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Dec 04, 2023

Darmmikrobiota als Antioxidationssystem bei Hundertjährigen, verbunden mit hohen antioxidativen Aktivitäten des Darms

npj Biofilms and Microbiomes Band 8, Artikelnummer: 102 (2022) Diesen Artikel zitieren 12.000 Zugriffe 6 Zitate 66 Altmetric Metrics Details Die Darmmikrobiota spielt eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit und

npj Biofilms and Microbiomes Band 8, Artikelnummer: 102 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Darmmikrobiota spielt eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit und Langlebigkeit, und die Darmmikrobiota von Hundertjährigen weist einzigartige Eigenschaften auf. Heutzutage beschränken sich die meisten mikrobiellen Forschungen zur Langlebigkeit in der Regel auf die Ebene der Bioinformatik, da validierende Informationen zur Kultivierung funktioneller Mikroorganismen fehlen. Hier kombinierten wir metagenomische Sequenzierung und groß angelegte In-vitro-Kulturen, um die einzigartige mikrobielle Darmstruktur der Stadt der Langlebigkeit der Welt aufzudecken – Jiaoling, China, Hundertjährige und Menschen unterschiedlichen Alters. Funktionelle Stämme wurden isoliert und in vitro gescreent, und der mögliche Zusammenhang zwischen Darmmikroben und Langlebigkeit wurde in vivo untersucht und validiert. An der Studie nahmen 247 gesunde kantonesische Ureinwohner unterschiedlichen Alters teil, darunter 18 Hundertjährige. Im Vergleich zu jungen Erwachsenen weist die Darmmikrobiota von Hundertjährigen eine höhere mikrobielle Diversität, einen höheren biologischen Abbau und Metabolismus von Xenobiotika, Oxidoreduktasen und mehrere Arten auf (die potenziellen Probiotika Lactobacillus, Akkermansia, das methanogene Methanobrevibacter, die butyratproduzierenden Darmmitglieder Roseburia und die SCFA-produzierenden Arten uncl). Clostridiales, uncl Ruminococcaceae), die sich bekanntermaßen positiv auf den Stoffwechsel des Wirts auswirken. Diese Arten verändern sich mit zunehmendem Alter ständig. Wir isolierten außerdem 2055 Stämme aus diesen Proben durch groß angelegte In-vitro-Kulturen, von denen die meisten durch Metagenomik nachgewiesen wurden, wobei die beiden Ansätze eindeutig komplementär waren. Wir haben auch einen altersbedingten, im Darm lebenden Lactobacillus mit unabhängigen geistigen Eigentumsrechten untersucht, und sein Metabolit (L-Ascorbinsäure) und er selbst haben gute antioxidative Wirkungen. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Existenz altersbedingter Verläufe in der menschlichen Darmmikrobiota und dass unterschiedliche Darmmikrobiota und darmresidente antioxidative Systeme zu Gesundheit und Langlebigkeit beitragen können.

Die Alterung der Bevölkerung ist heute ein wachsendes Problem, mit dem die Welt konfrontiert ist, und die Frage, wie man das Leben verlängert und ein gesundes Altern aufrechterhält, rückt zunehmend in den Mittelpunkt. Altern ist ein komplexer Prozess, und Wissenschaftler auf der ganzen Welt arbeiten hart daran, die zugrunde liegenden Mechanismen des Alterns zu erforschen und versuchen, das Altern zu verzögern, indem sie Schlüsselfaktoren identifizieren, die das Altern regulieren können1,2. Das Altern hängt mit einer Vielzahl von Faktoren zusammen, darunter der Genetik und der Umwelt, wobei genetische Faktoren 25–30 % und Umweltfaktoren 70–75 % ausmachen3,4. Neben verschiedenen Umweltfaktoren steht die Darmmikrobiota in engem Zusammenhang mit der menschlichen Gesundheit und Langlebigkeit5,6,7,8 und daher stellt sich die Darmmikrobiota als mögliches therapeutisches Ziel für das Altern dar und kann neue Strategien für ein gesundes Altern bieten9.

Experimente in verschiedenen Tiermodellen haben gezeigt, dass die Darmmikrobiota eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Langlebigkeit des Wirts spielt. Unter Verwendung eines Modellorganismus – des Afrikanischen Türkisen Killifisches (Nothobranchius furzeri), eines von Natur aus kurzlebigen Wirbeltiers – verlängert die Neubesiedelung des Darms von Individuen mittleren Alters mit Bakterien von jungen Spendern die Lebensdauer und verzögert den Verhaltensrückgang, was darauf hindeutet, dass die Darmmikrobiota eine Schlüsselrolle spielt bei der Regulierung der Lebensdauer von Wirbeltieren10. Der Drosophila-Darm ist aufgrund der Einfachheit der Mikrobiota und seiner physiologischen Ähnlichkeit mit dem Darm von Säugetieren das Modell der Wahl für die Untersuchung der Pathophysiologie des menschlichen Darms. Studien haben gezeigt, dass mikrobiell gewonnene Metaboliten, wenn sie durch Wirtsenzyme umgewandelt werden, den Epithelzellumsatz und die Langlebigkeit des Wirts beeinflussen können11. Der Nacktmull (Heterocephalus glaber) ist ein hervorragendes Modell für die Erforschung der Biologie des gesunden Alterns und der Langlebigkeit. Zum ersten Mal verglichen Wissenschaftler das mikrobielle Ökosystem des Darms von Nacktmullen mit dem von Menschen und anderen Säugetieren und fanden einige Zusammensetzungsmerkmale des Darmmikrobioms, die mit den mikrobiellen Ökosystemen des menschlichen Darms von Hundertjährigen und Hadza-Jägern und Sammlern gemeinsam sind. Diese Daten bestätigen die Bedeutung des mikrobiellen Ökosystems im Darm als adaptiver Partner für die Biologie und Gesundheit von Säugetieren12. Bei sozialen Insekten wie Honigbienen kann der gleiche Genotyp extreme Unterschiede in der Lebensdauer aufweisen. Alternde Darmmikrobiota von kurzlebigen (Arbeits-)Bienen produzieren Proteobakterien und dezimieren Lactobacillus und Bifidobacterium. Im Gegensatz dazu bewahren langlebige (Königinnen-)Honigbienen ihre jugendliche Zellfunktion bei einer viel geringeren Expression von Genen für oxidativen Stress, was eine einzigartige Perspektive auf die altersbedingte mikrobielle Nachfolge bietet13.

Klinische Studien haben auch gezeigt, dass die Vielfalt und Zusammensetzung der Darmmikrobiota nicht linear mit dem Alter verläuft. Bei Hundertjährigen war die Häufigkeit von Roseburia und Escherichia signifikant höher als bei Nicht-Hundertjährigen, während Lactobacillus, Faecalibacterium, Parabacteroides, Butyricimonas, Coprococcus, Megamonas, Mitsuokella, Sutterella und Akkermansia bei Hundertjährigen signifikant niedriger waren als bei Nicht-Hundertjährigen14. Die altersbedingten Verläufe des menschlichen Darmmikrobioms sind durch einen Verlust von Genen für die Produktion kurzkettiger Fettsäuren und eine allgemeine Abnahme des glykolytischen Potenzials gekennzeichnet, während proteolytische Funktionen häufiger vorkommen als im Darmmetagenom junger Erwachsener15. Eine Studie mit metagenomischer Sequenzierung zur Identifizierung von Zusammensetzungs- und Funktionsunterschieden in der Darmmikrobiota im Zusammenhang mit Altersgruppen auf Sardinien, Italien. Die Daten zeigten, dass die Darmmikrobiota sardischer Hundertjähriger im Vergleich zu Jung und Alt hauptsächlich durch eine Verarmung an Faecalibacterium prausnitzii und Eubacterium rectale gekennzeichnet war, während sie im Vergleich zu Jung und Alt durch eine Anreicherung von Methanobrevibacter smithii und Bifidobacterium jugendliche gekennzeichnet war. Die Funktionsanalyse zeigte, dass Hundertjährige über eine höhere Stoffwechselkapazität, insbesondere Glykolyse und Fermentation kurzkettiger Fettsäuren (SCFAs), sowie über niedrigere Gene verfügten, die für kohlenhydratabbauende Enzyme, einschließlich Ballaststoffe und Galaktose, kodieren16. Studien haben gezeigt, dass Hundertjährige über ein einzigartiges Darmmikrobiom verfügen, das reich an Mikroorganismen ist, die in der Lage sind, einzigartige sekundäre Gallensäuren zu produzieren, darunter verschiedene Isomere der Lithocholsäure (LCA). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Metabolismus spezifischer Gallensäuren an der Verringerung des Risikos einer pathogenen Infektion beteiligt sein und somit zur Aufrechterhaltung der Darmhomöostase beitragen kann17. Obwohl wir glauben, dass Langlebigkeit offenbar durch die Aufrechterhaltung der Homöostase der Darmmikrobiota erreicht wird, muss noch weiter untersucht werden, ob Veränderungen der Darmmikrobiota eine Folge oder eine Ursache des Alterns sind und der genaue Zusammenhang zwischen Darmmikrobiota und Alterung.

Obwohl zahlreiche metagenomische Studien durchgeführt wurden, um den Zusammenhang zwischen Darmmikrobiota und Lebensdauer zu untersuchen, war die metagenomische Analyse nicht in der Lage, lebensfähige Mikroorganismen für eine weitere Stammcharakterisierung oder Funktionsbewertung bereitzustellen17,18. Aufgrund der Grenzen der Metagenomik ist die tatsächliche Darmmikrobiota gesunder, langlebiger Menschen noch lange nicht vollständig verstanden. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass Culturomik diese Lücke offenbar schließen kann, denn solange der optimale Weg und geeignete Kulturbedingungen gefunden werden, scheinen alle Mikroorganismen kultivierbar zu sein19. Dies stellt eine wirksame Ergänzung zur metagenomischen Sequenzierung dar, um die mikrobielle Zusammensetzung des Darms umfassend zu charakterisieren. Derzeit weisen Kulturomik und Metagenomik ein hohes Maß an Komplementarität auf, da nur 15 % der getesteten Arten in beiden Technologien koexistieren20,21. Diese Ergebnisse wurden jedoch durch Metagenomik und kleinräumige Kultur-Omics erzielt, und es sind noch groß angelegte Kultur-Omics erforderlich, um diese Schlussfolgerung zu beweisen.

In dieser Studie kombinierten wir metagenomische Sequenzierung und groß angelegte In-vitro-Kulturen, um die einzigartige mikrobielle Darmstruktur der Stadt der Langlebigkeit der Welt aufzudecken – Jiaoling, China, Hundertjährige und Menschen unterschiedlichen Alters. Funktionelle Stämme wurden isoliert und in vitro gescreent, und der mögliche Zusammenhang zwischen Darmmikroben und Langlebigkeit wurde in vivo untersucht und validiert, wobei Zusammenhänge der Darmmikrobiota mit dem Alter und einer Reihe klinischer und metabolischer Parameter aufgedeckt wurden. Wir haben altersspezifische Merkmale der Darmmikrobiota aufgedeckt, darunter einen Kernsatz von sieben mikrobiellen Taxa, die bei Hundertjährigen angereichert sind, und die Darmmikrobiota von Hundertjährigen wiesen einen höheren biologischen Abbau und Metabolismus von Xenobiotika, Oxidoreduktase, auf. Wir haben in allen Populationen altersbedingte mikrobielle Eigenschaften des Darms aufgedeckt, darunter eine erhöhte Alpha-Diversität und ein erhöhtes Vorkommen gesundheitsrelevanter Bakterien wie Akkermansia, Lactobacillus und Produzenten kurzkettiger Fettsäuren (SCFA). verwandter, im Darm lebender Lactobacillus mit unabhängigen geistigen Eigentumsrechten, dessen Metaboliten und selbst gute antioxidative Wirkungen haben.

Insgesamt wurden 247 Teilnehmer aus „World Longevity Township – Jiaoling, China“ rekrutiert, darunter 18 Hundertjährige (Y120-Gruppe), 19 Personen im Alter von 81–99 Jahren (Y100-Gruppe), 77 Personen im Alter von 61–80 Jahren (Y80-Gruppe) und 81 Personen im Alter von 41–60 Jahren (Y60-Gruppe), 30 Personen im Alter von 21–40 Jahren (Y40-Gruppe) und 22 Personen im Alter von 0–20 Jahren (Y20-Gruppe) (Tabelle 1). Der multidisziplinären Gesundheitsbeurteilung zufolge waren die Personen gesund und hatten keine erkennbaren Krankheiten. Alle Probanden ernährten sich omnivor und hatten in den drei Monaten vor der Studie keine Antibiotika eingenommen (Abb. 1a; Tabelle S1).

Eine Übersicht über die Stichprobenregionen mit den acht ausgewählten Städten in Jiaoling (Stadt mit der weltweit höchsten Langlebigkeit), der südchinesischen Provinz Guangdong. 16S-rRNA-Gen- und Metagenomik-Sequenzanalyse sowie In-vitro- und In-vivo-Verifizierungsexperimentsprozess. b Die phylogenetische Beziehung der Top-100-Arten und altersbedingten Stämme auf Gattungsebene. Die statistische Analyse zwischen den Gruppen wurde als Mittelwert ± SD ausgedrückt, Fehlerbalken waren Standardabweichung.

Die Jiaoling-Kohorte wurde gegründet, um zu untersuchen, wie die Darmmikrobiota mit dem Altern zusammenhängt. Aus dieser Kohorte wurden 16S-rRNA-Gen-Amplikon- und metagenomische Daten von Stuhlproben aller Personen im Alter von 0–110 Jahren mit dem Stoffwechselstatus des Wirts analysiert und Stämme unter Anleitung der Metagenomik isoliert, in vitro gescreent und die antioxidative Funktion in vivo überprüft (Abb . 1a; Tabelle S1).

Die Alpha-Diversitätsindizes, einschließlich der beobachteten Arten Chao1, Shannon und ACE, waren in älteren Gruppen (Y80, Y100, Y120) deutlich erhöht als in jüngeren Gruppen (Y20, Y40, Y60) (Abb. S1a-d). Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen von Sepp et al.22, die zeigten, dass der Reichtum und die Vielfalt der Mikrobiota sowie die Häufigkeit erblicher und umweltbedingter Mikroben bei Menschen mit langer Lebenserwartung höher waren als bei jungen Menschen. Laut PCoA unterschied sich die Darmmikrobiota der älteren Gruppen (Y80, Y100, Y120) unter Verwendung der ungewichteten UniFrac-Distanz signifikant von der der jüngeren Gruppen (Y20, Y40, Y60) (Abb. S1e). Wir haben keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen Y20, Y40, Y60 oder zwischen den Gruppen Y80, Y100, Y120 (Abb. S1a – d) sowohl für die Alpha-Diversität als auch für die Beta-Diversität beobachtet. Bian et al.23 zeigten jedoch, dass die Darmmikrobiota gesunder alter Chinesen der gesunder junger Menschen ähnelt. Obwohl die mikrobielle Vielfalt ein Parameter zur Beschreibung eines gesunden Mikrobioms war, muss sie als Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen ökologischer Mechanismen dienen24.

Die Darmmikrobiota bestand aus 270 Gattungen und 107 Familien, die gemäß 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung zu 22 Phyla gehörten. Den Ergebnissen der Artenanmerkungen zufolge (Abb. S1f – h) umfassten die Stammmengen der Darmmikrobiota hauptsächlich Firmicutes, Bacteroidetes und Proteobacteria (Abb. S1f). Methanobacteriaceae, Akkermansiaceae, Muribaculaceae, Ruminococcaceae, Christensenellaceae und Lactobacillaceae wiesen in der Y120-Hundertjährigengruppe auf Familienebene eine höhere Häufigkeit auf als in anderen Gruppen. Lachnospiraceae, Burkholderiaceae und Bifidobacteriaceae waren weniger häufig (Abb. S1g). Die potenziell nützlichen Bakteriengruppen Akkermansiaceae, Lactobacillaceae und Christensenellaceae wurden auch in der Hundertjährigengruppe Y120 gefunden. Ihre Häufigkeit nahm mit zunehmendem Alter allmählich zu, was früheren Berichten folgte25,26. Auf Gattungsebene zeigten die Arten Akkermansia, Methanobrevibacter, Klebsiella, Parabacteroides, Phascolarctobacterium, Barnosiella, Alisipes, Butyricimonas, Lachnoclostridium und Blautia in der Y120-Hundertjährigengruppe eine höhere Häufigkeit als in anderen Gruppen (Abb. S1h). Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen von Palmas et al.27, die zeigten, dass die wichtigsten mit Hundertjährigen verbundenen Biomarker zum Stamm der Verrucomicrobia gehörten, einschließlich der Art Akkermansia muciniphila, die aufgrund ihrer Fähigkeit, die Darmintegrität zu fördern, als bedeutender Biomarker der Darmhomöostase gilt . Wir analysierten die phylogenetische Verwandtschaft der Top-100-Arten auf Gattungsebene und stellten deutlich fest, dass die relative Häufigkeit von Akkermansia, Methanobrevibacter, Klebsiella, Parabacteroides, Phascolarctobacterium, Barnosiella, Alisipes, Butyricimonas, Lachnoclostridium und Blautia usw. mit dem Alter allmählich zunimmt (Abb . 1b). Studien haben gezeigt, dass Akkermansia die Lebensdauer vorzeitig alternder Mäuse verlängern und die Darmbarriere stärken kann28,29.

Nachdem wir gut charakterisierte Kohorten mit einer Zunahme der Diversität der Darmmikrobiota hatten, fragten wir als Nächstes, ob wir in diesen Kohorten altersbedingte mikrobielle Merkmale des menschlichen Darms identifizieren könnten. Bemerkenswert ist, dass wir in den älteren Gruppen (Y80, Y100, Y120) hohe Werte von 13 Gattungen fanden. Zu diesen Gattungen gehörten die potenziellen Probiotika Lactobacillus, Akkermansia, die methanogenen Methanobrevibacter, Alistipes, Parabacteroides, uncl Erysipelotrichaceae, Butyrivibrio, Butyricimonas, Barnesiella, Phascolarctobacterium, die Darmbutyrat produzierenden Mitglieder Roseburia und SCFA-produzierende Arten wie uncl Clostridiales und uncl Ruminococcaceae. (Abb. 1b, Abb. 2a, Abb. S2). Daher definierten wir diese Taxa als altersbedingte Kerntaxa mit zunehmendem Alter, bei denen komplexe, gleichzeitig auftretende Netzwerkbeziehungen auftraten (Abb. 2b). Interessanterweise stellten wir fest, dass altersbedingte Barnesiellaceae signifikant umgekehrt mit Stoffwechselprofilen (Abb. 3a) wie BMI, CHOL und TG-Spiegeln assoziiert waren; Lactobacillaceae korrelierten signifikant mit klinischen Parametern, einschließlich GLO und BUN; Akkermansiaceae korrelierten signifikant mit den klinischen Parametern GLO (Abb. 3a). Anhand der klinischen Parameter jeder Gruppe kann beobachtet werden, dass der Körpergesundheitsindex der Personen im Langlebigkeitsbereich gut war (Abb. 3b). Bemerkenswert ist, dass kausale Zusammenhänge zwischen Akkermansia und den metabolischen Vorteilen des Wirts bei Mäusen und Menschen nachgewiesen wurden Studien30,31 und es wurde berichtet, dass ein hohes Vorkommen von Alistipes mit einem geringen Risiko für atherosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen32, niedrige TG-Werte oder einen niedrigen BMI33,34 verbunden ist. Diese Daten charakterisierten die Entwicklung der Darmmikrobiota mit zunehmendem Alter.

a Relative Häufigkeit der altersbedingten Darmmikrobiota Lactobacillus, Akkermansia, Methanobrevibacter, Alistipes, Parabacteroides, Uncl Erysipelotrichaceae, Butyrivibrio, Butyricimonas, Barnesiella, Phascolarctobacterium, Roseburia, Uncl Clostridiales und Uncl Ruminococcaceae zwischen jüngeren (Y20, Y40, Y60) und älteren ( Y80, Y100, Y120) Gruppen nach Wilcoxon-Rangsummentest, * bedeutet p < 0,05; ** zeigt p < 0,01 an; *** zeigt p < 0,001 an. b Koexistenz-Netzwerkanalyse der Darmmikrobiota auf Gattungsebene. Unterschiedliche Knoten repräsentieren unterschiedliche Gattungen, die Größe des Knotens stellt die durchschnittliche relative Häufigkeit der Gattung dar, die Knoten desselben Stammes haben die gleiche Farbe und die Dicke der Linie zwischen den Knoten korreliert positiv mit dem Absolutwert des Korrelationskoeffizienten der Arteninteraktion. Die positive und negative Entsprechung zwischen der Farbe der Verbindung und der Korrelation (rot positive Korrelation, blau negative Korrelation).

a Korrelationen zwischen der relativen Häufigkeit ausgewählter Bakterienfamilien und klinischen Parametern. Korrelationen mit p < 0,05 werden angezeigt. Spearmans Rho-Statistik wurde mithilfe der Benjamini- und Hochberg-Methode angepasst. Alter Jahre alt, Hei-Größe, Wei-Gewicht, BMI-Body-Mass-Index, NCE-Halsumfang, ACE-Bauchumfang, WSBP-systolischer Blutdruck, WDP-diastolischer Blutdruck, CHO-Cholinesterase, ALB-Albumin, GLO-Globulin, γ-GPE-γ-Glutamyltranspeptidase, ALK alkalische Phosphatase, AST Aspartataminotransferase, TBN Gesamtbilirubin, ALT Alaninaminotransferase, Ca Calcium, BUN Harnstoffstickstoff, UA Harnsäure, Cr Kreatinin, CHOL Gesamtcholesterin, TG Triglyceride, HDL.c High Density Lipoprotein, LDL.c Low-Density Dichte-Lipoprotein. Glykiertes HBA1c-Hämoglobin, PLC-Thrombozytenzahl, WBCC-Leukozytenzahl, LAV-Absolutlymphozytenwert, NAV-Absolutwert der Neutrophilen, Hb-Hämoglobinkonzentration. b Klinische Parameter aller Gruppen. Veränderungen der klinischen Indikatoren verschiedener Altersgruppen. * zeigt p < 0,05 an; ** zeigt p < 0,01 an; *** zeigt p < 0,001 an; ns nicht signifikant, einfaktorielle ANOVA-Varianzanalyse und ausgedrückt als Mittelwert ± SD, Fehlerbalken waren Standardabweichung.

Auf der funktionellen Ebene haben wir beobachtet, dass eine große Anzahl von Stoffwechselwegen durch metagenomische Sequenzierung, wie z. B. Kohlenhydratstoffwechsel, Aminosäurestoffwechsel, Metabolismus von Cofaktoren und Vitaminen, Glykanbiosynthese und -stoffwechsel, Lipidstoffwechsel, Metabolismus anderer Aminosäuren, Biosynthese anderer Sekundärmetaboliten, Metabolismus von Terpenoiden und Polyketiden sowie biologischer Abbau und Metabolismus von Xenobiotika. Im Vergleich zu jüngeren Gruppen enthielt die Darmmikrobiota älterer Gruppen eine höhere Häufigkeit einer Reihe von Genen, die mit dem biologischen Abbau und Metabolismus von Xenobiotika zusammenhängen und einen signifikanten Zusammenhang mit zunehmendem Alter aufwiesen (Abb. 4a). Bemerkenswert ist, dass wir festgestellt haben, dass ein hoher Grad an Aminobenzoatabbau, Atrazinabbau, Benzoatabbau, Caprolactamabbau, Chlorcyclohexan- und Chlorbenzolabbau, Dioxinabbau, Ethylbenzolabbau, Fluorbenzoatabbau, polyzyklischem aromatischem Kohlenwasserstoffabbau, Styrolabbau, Toluolabbau und Xylolabbau signifikant ist Assoziationen mit zunehmendem Alter (Abb. S3a).

Ein Boxplot und ein Balkendiagramm mit der Anmerkung zum mikrobiellen KEGG-Signalweg im Darm (Bioabbau und Metabolismus von Xenobiotika, Aminosäuremetabolismus, Kohlenhydratmetabolismus, Lipidmetabolismus, Biosynthese anderer sekundärer Metaboliten, Metabolismus anderer Aminosäuren, Metabolismus von Cofaktoren und Vitaminen, Glykanbiosynthese usw.) Stoffwechsel, Stoffwechsel von Terpenoiden und Polyketiden). P-Werte wurden aus zweiseitigen Wilcoxon-Rangsummentests erhalten. Bei allen Box- und Whisker-Plots stellt die Mittellinie den Median dar. Die Grenzen der Box stellen das erste und dritte Quartil dar. Der obere Whisker erstreckt sich vom Scharnier bis zum größten Wert, der nicht weiter als 1,5 * Interquartilbereich (IQR) vom Scharnier entfernt ist. Der untere Whisker erstreckt sich vom Scharnier bis zum kleinsten Wert von höchstens 1,5 * IQR des Scharniers. b Heatmap, die die mikrobiellen Darmfunktionen von RNA-Polymerase, Dehydrogenase, Methyltransferase, Oxidoreduktase und Acetyltransferase in sechs Altersgruppen zeigt. Boxdiagramm, das die Veränderungen von Superoxiddismutase, Glutathiontransferase und Katalase in Abhängigkeit von den Altersgruppen zeigt. c, d Korrelationen zwischen der ausgewählten altersbedingten Bakteriengattung und dem Stoffwechselweg sowie der Oxidoreduktase. * zeigt p < 0,05 an; ** zeigt p < 0,01 an; *** zeigt p < 0,001 gemäß Wilcoxon-Rangsummentest an.

Wir beobachteten auch, dass eine große Anzahl von Oxidoreduktasen, Methyltransferasen, Acetyltransferasen und Dehydrogenasen in der Y120-Gruppe, wobei Superoxiddismutase, Glutathiontransferase und Katalase signifikante Assoziationen mit zunehmendem Alter aufweisen (Abb. 4b, Abb. S3b). Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass altersbedingte Darmfunktionsmerkmale wie der biologische Abbau und Stoffwechsel von Xenobiotika sowie die Oxidoreduktase einen signifikanten Zusammenhang mit zunehmendem Alter haben. Bemerkenswert ist, dass auch die altersbedingte Darmmikrobiota und -funktion signifikante Assoziationen aufwies, wobei Akkermansia signifikante Assoziationen mit dem biologischen Abbau und Metabolismus von Xenobiotika, der Glykanbiosynthese und dem Metabolismus, der Biosynthese anderer sekundärer Metaboliten, Superoxiddismutase und Katalase aufwies; Lactobacillus weist signifikante Assoziationen mit dem biologischen Abbau und Metabolismus von Xenobiotika, dem Metabolismus von Terpenoiden und Polyketiden sowie der Superoxiddismutase auf (Abb. 4c, d). Diese Daten deuteten auf altersbedingte Darmfunktionsmerkmale hin.

Nachdem wir die altersbedingte Darmmikrobiota und -funktion gut charakterisiert hatten, fragten wir als nächstes, ob wir diese altersbedingten Darmmikrobiota und -funktionsstämme gezielt trennen und untersuchen könnten. Tatsächlich haben wir zahlreiche signifikante Zusammenhänge zwischen Alter und mikrobieller Vielfalt, der relativen Artenhäufigkeit oder Funktion in Jiaoling, China (World Longevity Township), festgestellt.

Um die Korrelation zwischen diesen altersbedingten Darmmikrobiota und Funktionsstämmen zu überprüfen, haben wir 2055 Stämme getrennt und gereinigt, darunter Lactobacillus 26,67 %, Enterococcus 20,63 %, Escherichia 18,39 %, Weissella 14,21 %, Lactococcus 5,35 %, Pediococcus 4,48 %, Streptococcus 2,68 %. , Klebsiella 1,65 %, unkultiviertes Bakterium 1,51 %, Staphylococcus 1,31 %, Shigella 0,68 %, Bacillus 0,49 %, usw. (Abb. 5, Abb. S4a). Da nur ein einziges Medium ausgewählt und in einer anaeroben Umgebung kultiviert wurde, haben wir nicht alle altersbedingten Stämme isoliert, die anhand der oben genannten Big Data analysiert wurden. Glücklicherweise haben wir eine große Anzahl von Lactobacillus isoliert, darunter hauptsächlich L. salivarius, L. fermentum, L. plantarum, L. mucosae, L. gasseri, L. paragasseri, L. animalis, L. Crispatus usw. (Abb. 5). ).

Das Kreisdiagramm zeigt den Anteil aller aus der Stuhlprobe isolierten Stämme auf Gattungsebene. Insgesamt wurden 2.055 Stämme isoliert. Das Balkendiagramm zeigt die detaillierte Zusammensetzung der wichtigsten 6 aus der Stuhlprobe isolierten Gattungen, darunter Lactobacillus, Enterococcus, Escherichia, Weissella, Lactococcus und Pediococcus.

Als nächstes wurden einige fäkale Isolationsstämme für das Screening antioxidativer Probiotika ausgewählt. Nach einem vorläufigen Screening (Bakteriensuspension) und einem erneuten Screening (Bakteriensuspension, extrazelluläre Substanz, intrazelluläre Substanz und Bakterienfragment) wurde schließlich ein Stamm mit starker antioxidativer Aktivität namens Lactobacillus plantarum 124 (LP124) in vitro gescreent. Zu den Antioxidantien-Screening-Indikatoren gehörten die Abfangraten von 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), reduzierende Aktivitäten des L-Cystein-Äquivalents (μmol/L), die Abfangraten von freien Hydroxylradikalen (·OH) und die Chelatbildungsraten von Eisenionen (Fe2+), Abfangraten des Superoxidanions (O2−) und Hemmung der Lipidperoxidation (Tabelle S2, 3, Abb. S5j). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein Stamm mit besserer antioxidativer Aktivität aus Darmmikroorganismen isoliert und in vitro untersucht wurde und ihm den Namen Lactobacillus plantarum124 gab.

Wir hatten den bekannten altersbedingten Stamm LP124 mit antioxidativer Aktivität in vitro, aber unabhängig davon, ob es in vivo Oxidoreduktase-bezogene Gene gab, führten wir eine Sequenzierung des gesamten Genoms mit der Gesamtbasenlänge der Sequenz 3210286, (C+G) % 44,61 % durch. Anschließend wurden die Funktionen der Gene mit der GO-Datenbank (Gene Ontology) und die Pfade mit der KEGG-Datenbank (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) annotiert. Interessanterweise fanden wir heraus, dass es eine große Anzahl biologischer Prozesse, molekularer Funktionen und zellulärer Komponentengene gibt, darunter Stoffwechselprozesse, zelluläre Prozesse, katalytische Aktivität, Bindung, Transporteraktivität und antioxidative Aktivität. Schließlich wurden 12 GO-Nummern mit antioxidativer Aktivität und 140 Gene mit antioxidativer Aktivität gefunden (Abb. 6, Abb. S4b). Die Oxidoreduktase-bezogenen Gencluster sind annotiert und umfassen hauptsächlich srlD: Oxidoreduktase der SDR-Familie (EC:1.1.1.140, ko00051 Fructose- und Mannose-Metabolismus), ndh: NAD(P)/FAD-abhängige Oxidoreduktase (EC:1.6.99.3, ko00190 Oxidativ). Phosphorylierung), gpx: Glutathionperoxidase (EC:1.11.1.9, ko00480 Glutathionstoffwechsel; ko00590 Arachidonsäurestoffwechsel; ko04918 Schilddrüsenhormonsynthese), trxA: Thioredoxin (ko04621 NOD-ähnlicher Rezeptorsignalweg; ko05418 Flüssigkeitsscherstress und Atherosklerose), trxB : Thioredoxin-Disulfid-Reduktase (EC:1.8.1.9, ko00240 Pyrimidin-Metabolismus; ko00450 Selenocompound-Metabolismus), msrA: Peptid-Methionin (S)-S-Oxid-Reduktase (EC:1.8.4.11) und katE, CAT, catB, srpA : Katalase (EC:1.11.1.6, ko00380 Tryptophan-Metabolismus; ko00630 Glyoxylat- und Dicarboxylat-Metabolismus; ko01200 Kohlenstoffmetabolismus; ko04011 MAPK-Signalweg-Hefe; ko04016 MAPK-Signalweg) usw. (Abb. 6). Wir fanden auch eine große Anzahl von Genen, wie z. B. den Kohlenhydratstoffwechsel, den Aminosäurestoffwechsel, den Energiestoffwechsel, den Nukleotidstoffwechsel, den Lipidstoffwechsel, den Stoffwechsel anderer Aminosäuren sowie den biologischen Abbau und Stoffwechsel von Xenobiotika (Abb. S4c). Durch pangenomische Analyse haben wir die spezifische molekulare Zielsequenz 124_03212 von LP124 ausgegraben (Abb. S4d) und sie im Kultursammelzentrum des Instituts für Mikrobiologie der Guangdong Academy of Sciences mit der Hinterlegungsnummer GDMCC61123 hinterlegt (Tabelle S4). Diese Ergebnisse legen nahe, dass LP124 in vivo mit einer Vielzahl von Oxidoreduktase-bezogenen Genen ausgestattet ist.

LP124-Genomkreiskarte und Oxidoreduktase-bezogene Gene. Die kodierenden Gene wurden von BLAST mit der NR-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) annotiert. Von außen nach innen: Der erste Kreis ist die Genompositionsinformation, der zweite Kreis ist die GC-Gehaltsinformation, der dritte Kreis ist das kodierende Gen in der positiven Kette (rot markiert) und der vierte Kreis ist das kodierende Gen auf der negativen Kette (grün markiert), der fünfte Kreis ist die ncRNA-Information auf dem positiven Strang (blau markiert), der sechste Kreis ist die ncRNA-Information auf dem negativen Strang (violett markiert) und der siebte Kreis ist die Informationen zu langen repetitiven Sequenzen im Genom (orange markiert), der achte Kreis stellt Gene dar, die mit Oxidoreduktase in Zusammenhang stehen.

Um weiter zu testen, ob das im Darm vorkommende LP124 auch oxidativen Stress bei Tieren lindern kann, wurde LP124 Mäusen intragastrisch injiziert (Abb. 7a, Abb. S5k, l). Die mikrobiellen Darmprofile der Empfängermäuse wurden nach 8 Wochen durch 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung analysiert (Abb. S5a – c). Wie erwartet könnte LP124 die Zusammensetzung und Funktion der Darmmikrobiota oxidativ geschädigter Mäuse regulieren. Darüber hinaus nahm auf Gattungsebene die Häufigkeit bei Akkermansia, Bacteroides, Alloprevotella, Prevotellaceae_UCG-001 und Lachnospiraceae_NK4A136 im Vergleich zur Modellgruppe zu (Abb. S5a). Darüber hinaus haben wir auf funktioneller Ebene beobachtet, dass eine große Anzahl von Kohlenhydratstoffwechseln, Aminosäurestoffwechseln, Lipidstoffwechseln, dem biologischen Abbau von Xenobiotika und dem Stoffwechsel von Lactobacillus erfolgt. Diese Ergebnisse zeigten tiefgreifende Veränderungen in der Zusammensetzung und Funktion der Darmmikrobiota der LP124-Gruppe, was auf die Bedeutung von LP124 für die Entwicklung von Darmmikroben hinweist.

ein Schema des experimentellen Designs von Mäusen. b, e Bestimmung der antioxidativen Kapazität von Mäuseleber und -niere, einschließlich Glutathionperoxidase (GSH-Px)-Aktivität, Superoxiddismutase (SOD)-Aktivität, Thioredoxinreduktase (TrxR)-Aktivität, Gesamtantioxidationskapazität (T-AOC), Malondialdehyd (MDA)-Gehalt, Gesamtgehalt an Carbonyl (Carbonyl). c, f Die relative Expression von GSH-Px, SOD, Nrf2, TrxR in Leber- und Nierengewebe oxidativ geschädigter Mäuse. d Histomorphologische Analyse von Leber, Niere und Darm verschiedener Mäusegruppen (ursprüngliche Vergrößerung, ×400; Maßstabsbalken = 50 µm). g Endotoxinbestimmung im Mäuseserum. Unterschiedliche Buchstaben (a, b, c, d) in der Abbildung weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen hin (p < 0,05, einfaktorielle ANOVA-Analyse), und dieselben Buchstaben weisen auf keine signifikanten Unterschiede hin. Die statistische Analyse zwischen den Gruppen wurde als Mittelwert ± SD ausgedrückt, Fehlerbalken waren Standardabweichung.

Es wird angenommen, dass Glutathionperoxidase (GSH-Px), Superoxiddismutase (SOD), Thioredoxinreduktase (TrxR), die Gesamtantioxidationskapazität (T-AOC), Malondialdehyd (MDA), Carbonyl und Endotoxin (ET) eine Schlüsselrolle spielen Pathophysiologie von Schäden durch oxidativen Stress. Nach 8 Wochen zeigten Modellmäuse im Vergleich zu Kontrollmäusen in der Leber deutlich niedrigere GSH-Px-, SOD-, TrxR- und T-AOC-Spiegel sowie höhere MDA- und Carbonylspiegel. Bemerkenswert ist, dass LP-Mäuse im Vergleich zu Modellmäusen signifikant höhere GSH-Px-, SOD-, TrxR- und T-AOC-Werte sowie niedrigere MDA- und Carbonylwerte aufwiesen (Abb. 7b). Auch die Nieren von LP-Mäusen zeigten ähnliche Ergebnisse wie die Leber (Abb. 7e). Als nächstes untersuchten wir Veränderungen in den Genen GSH-Px, SOD, TrxR und der Expression des Nuclear Factor-Erythroid 2-Related Factor 2 (Nrf2)-Botenstoffs in Leber und Niere. Insbesondere waren die Spiegel von GSH-Px-, SOD-, TrxR- und Nrf2-mRNA in der LP-Gruppe im Vergleich zu denen in der Modellgruppe für Mäuse signifikant erhöht (Abb. 7c, f). Um festzustellen, wie sich LP124 auf Leber und Niere auswirkt, haben wir deren Struktur untersucht. Die histomorphologische Analyse ergab eine signifikante strukturelle Veränderung der Leber in der Modellgruppe im Vergleich zu denen in der Kontrollgruppe (Abb. 7d). Darüber hinaus waren in der Modellgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe Unterschiede in der Nierenmorphologie erkennbar (Abb. 7d). Die Modellmäuse wiesen einige schwerwiegende Läsionen in Leber und Niere auf. In der LP-Gruppe ähnelte die Leber- und Nierenmorphologie jedoch der der Kontrollgruppe. Darüber hinaus wurden in den LP- und Vitamin C (Vc)-Gruppen keine sichtbaren histopathologischen Anomalien beobachtet (Abb. 7d). Diese Ergebnisse zeigten, dass LP124 die Funktion hat, oxidativen Stress in Leber und Nieren zu lindern.

Es ist bekannt, dass beeinträchtigte Körpergesundheitsreaktionen im Darm mit einer Funktionsstörung der Darmbarriere verbunden sind35. Wir untersuchten, ob das im Darm vorkommende LP124 die Funktion der Darmbarriere beeinflusst. LP124 senkte den Plasma-Endotoxinspiegel bei LP-Mäusen deutlich (Abb. 7g). Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von LP124 auf histopathologische Veränderungen im Darm. Es gab eine signifikante strukturelle Veränderung des Darms in der Modellgruppe im Vergleich zu denen in der Kontrollgruppe und keinen offensichtlichen Unterschied in der Morphologie des Epithels bei LP-Mäusen im Vergleich zur Vc-Gruppe (Abb. 7d). Diese Ergebnisse zeigten, dass LP124 die Funktion hat, die Darmbarriere zu schützen.

Um den Mechanismus zu bestimmen, durch den im Darm ansässiges LP124 aus der Ferne eine antioxidative Aktivität ausübt, haben wir die im Serum von LP124-behandelten Tieren vorhandene niedermolekulare Substanz im Vergleich zur Modellgruppe mittels LC-MS charakterisiert. Anschließende Tandem-Massenspektrometrie identifizierte mögliche kleine Moleküle, die im Serum von LP124-behandelten Tieren signifikant angereichert waren, von denen 2 negativ als L-Ascorbat und Mesaconsäure identifiziert wurden (Abb. 8a, d, Abb. S5f, h), während 5 wurden positiv als Lysinbutyrat, D-Alanyl-D-Alanin, Noroxycodon-d3, PC (16:1/16:1) und PC (17:1/17:2) identifiziert (Abb. 8b, Abb. S5d, g , ich). Weitere Analysen ergaben, dass 15 Stoffwechselwege mit signifikanten Unterschieden an den oben genannten Metaboliten beteiligt waren (Abb. 8c, Abb. S5e). Glücklicherweise haben wir unter diesen 7 deutlich angereicherten kleinen Molekülen einen sehr wichtigen Metaboliten L-Ascorbat entdeckt, der bekanntermaßen eine sehr starke antioxidative Wirkung hat36,37,38. Um diese Ergebnisse zu untermauern, haben wir die oxidative Aktivität von Vc (L-Ascorbat) in vivo bestimmt. Wir beobachteten bei Vc-Mäusen im Vergleich zu Modellmäusen einen signifikant höheren Spiegel von GSH-Px, SOD, TrxR, T-AOC und niedrigere MDA- und Carbonylspiegel in Leber und Niere (Abb. 7b, e). Ebenso waren die Expressionsniveaus von GSH-Px-, SOD-, TrxR- und Nrf2-mRNA in Leber und Niere in der Vc-Gruppe im Vergleich zu denen in der Modellgruppe für Mäuse signifikant erhöht (Abb. 7c, f). Darüber hinaus gab es keinen offensichtlichen Unterschied in der Morphologie des Epithels bei Vc-Mäusen im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 7d).

a, b Durch ultrahochauflösende Massenspektrometrie identifizierte Merkmale verschiedener Metaboliten waren in der LP-Gruppe im Vergleich zur Modellgruppe deutlich hoch- und runterreguliert. Das Vulkandiagramm kann die Gesamtverteilung verschiedener Metaboliten visuell darstellen. Die deutlich hochregulierten Metaboliten werden durch rote Punkte dargestellt, die deutlich herunterregulierten Metaboliten werden durch grüne Punkte dargestellt und die Größe des Punkts stellt den VIP-Wert dar. c Blasendiagramm zur Anreicherung des KEGG-Signalwegs. Je größer der Wert der Abszisse ist, desto höher ist die Anreicherung differenzieller Metaboliten im Stoffwechselweg. Die Farbe des Punktes stellt den p-Wert des hypergeometrischen Tests dar. Je kleiner der Wert, desto größer die Zuverlässigkeit des Tests und desto statistisch signifikanter. Die Größe des Punktes stellt die Anzahl der verschiedenen Metaboliten im entsprechenden Stoffwechselweg dar. Je größer der Punkt, desto mehr unterschiedliche Metaboliten sind im Stoffwechselweg vorhanden. d Korrelationsdiagramm verschiedener Metaboliten (pos ist der positive Ionenmodus, neg ist der negative Ionenmodus). Positive Korrelation ist rot und negative Korrelation ist blau. Der Teil ohne Farbe zeigt einen p-Wert > 0,05 an. Die Abbildung zeigt die Korrelation der wichtigsten 20 Differenzialmetaboliten, sortiert nach p-Wert von klein nach groß. e Diagramm verwandter Wege von L-Ascorbat.

Um schließlich festzustellen, ob der Ursprung von L-Ascorbat von LP124 stammt, führten wir eine Metabolomikanalyse durch (Tabelle S5,6). Nachfolgende Massenspektrometrie zeigte eine Anreicherung von L-Ascorbat in LP124-Kulturüberständen (Tabelle S5). Weitere Analysen ergaben, dass einige Stoffwechselwege an den L-Ascorbat-Metaboliten beteiligt sind, darunter der Ascorbat- und Aldarat-Metabolismus, die Vitaminverdauung und -absorption, der HIF-1-Signalweg und der Glutathion-Metabolismus. Insbesondere L-Ascorbat als Metabolit des Fruktose- und Mannosestoffwechsels sowie des Aminozucker- und Nukleotidzuckerstoffwechsels ist in Abb. 8e dargestellt. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das im Darm vorkommende, aus Lactobacillus stammende kleine Molekül L-Ascorbat als wirksame Substanz bei der antioxidativen Reaktion fungieren kann.

Jiaoling, China, die langlebigste Gemeinde der Welt, hat einen hohen Anteil an Hundertjährigen, eine relativ einheitliche Bevölkerung und einen einzigartigen Lebensstil und eine einzigartige Ernährung. Es ist ein idealer Bereich für die Erforschung der Langlebigkeit. Daher wird eine eingehende Untersuchung der Darmmikrobiota von Hundertjährigen in Jiaoling, einer Stadt der Langlebigkeit auf der Welt, dazu beitragen, unser Verständnis der Mechanismen der Langlebigkeit zu vertiefen. Obwohl die Darmmikrobiota als wichtiger Faktor für die menschliche Gesundheit gilt39, sind die Struktur der Darmmikrobiota und die Mechanismen, die die Langlebigkeit langlebiger Populationen beeinflussen, nicht vollständig geklärt. Darüber hinaus bleibt es eine große Herausforderung, die Zusammensetzung der Darmmikrobiota gründlich zu analysieren. Der Hauptzweck dieser Studie bestand darin, die regionalen Langlebigkeitsfaktoren der „World's Longevity Township – Jiaoling, China“ herauszufinden, indem die Darmmikrobiota-Merkmale von Menschen unterschiedlichen Alters ausschließlich in China charakterisiert wurden. Deshalb haben wir die Eigenschaften der Darmmikrobiota der langlebigen Bevölkerung in Jiaoling, der weltweiten Gemeinde für Langlebigkeit, mithilfe von Metagenomik und Kulturomik eingehend untersucht, ohne die großen Datenmengen anderer Länder oder sogar der Welt auszuwählen. Nach unserem besten Wissen war dies die erste Studie, die die metagenomische Sequenzierung fäkaler Mikroben mit groß angelegten Kultur-Omics in Jiaoling, einer Stadt der Langlebigkeit auf der Welt, kombinierte, um den Zusammenhang zwischen Darmmikrobiota und gesunder Langlebigkeit gründlich zu untersuchen. In dieser Studie führten wir eine umfassende Kohortenanalyse in der langlebigsten Stadt der Welt – Jiaoling, China – durch und zeigten die Existenz altersbedingter Zusammensetzungs- und Funktionsmerkmale von Darmmikroben. Wir zeigen auch eine bisher unterschätzte Rolle von Mikroben bei antioxidativen Reaktionen. Darüber hinaus identifizierten wir Laktobazillen als Vermittler dieser Wirkung, teilweise aufgrund ihrer Produktion von L-Ascorbinsäure, da wir L-Ascorbinsäure sowohl im Kulturüberstand von In-vitro-Kulturen von Lactobacillus als auch im Serum von Lactobacillus plantarum 124-Sondensonde nachwiesen Tiere (Abb. 9).

Das Vorhandensein altersbedingter Verläufe in der menschlichen Darmmikrobiota sowie dieser unterschiedlichen Darmmikrobiota und darmresidenten antioxidativen Systeme können zu Gesundheit und Langlebigkeit beitragen.

In unserer Studie zeigten ältere Menschen, insbesondere die Gruppe der Hundertjährigen, eine höhere mikrobielle Diversität im Darm als die jüngere Gruppe, verglichen mit der allgemeinen Jugend, die in derselben Region lebte. Die Struktur und Funktion des Darmmikrobioms von Hundertjährigen weist einzigartige Merkmale auf. Studien haben jedoch gezeigt, dass Hundertjährige häufig durch eine verminderte Alpha-Diversität, eine verminderte Anzahl butyratproduzierender Bakterien (z. B. Faecalibacterium, Rosetella, Eubacterium und Ruminococcus) und eine Zunahme opportunistischer Krankheitserreger gekennzeichnet sind40. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass die Transitzeiten im Dickdarm bei Menschen mittleren Alters länger sind als bei jüngeren Erwachsenen41,42, und längere Darmtransitzeiten sind mit einer höheren mikrobiellen Diversität im Darm verbunden43. Darüber hinaus ergab unsere Studie, dass die ältere Bevölkerung auch eine höhere Häufigkeit einiger gesunder Bakterienarten aufweist, wie z. B. Akkermansia, Lactobacillus und viele SCFA-produzierende Bakterien (Abb. 9). Akkermansiaceae, Lactobacillaceae und Barnesiellaceae usw. korrelierten signifikant mit klinischen Parametern. Wir müssen das chronologische Altern vom biologischen Altern unterscheiden. Das chronologische Alter stellt das tatsächliche Alter einer Person dar und wird auf der Grundlage der im Leben einer Person verstrichenen Zeit berechnet44. Das biologische Alter bezieht sich auf den allgemeinen Gesundheitszustand einer Person zu einem bestimmten Zeitpunkt des physiologischen Alters. Im Allgemeinen sollten die Umgebung, die Ernährung, das Leben und psychologische Faktoren berücksichtigt werden. Es hat sich gezeigt, dass das biologische Alter ein besserer Prädiktor ist als das chronologische Alter, und seine Messung kann die Beurteilung des koloskopiebedingten kolorektalen Adenomrisikos erleichtern45. Dyslipidämie, Diabetes und Entzündungen sind ebenfalls altersbedingte Erkrankungen. Mit diesen Biomarkern könnten sie zumindest eine Revalidierung der altersassoziierten taxonomischen Marker durchführen. Das Ausmaß des biologischen Alterns für Einzelpersonen könnte auf den altersbedingten Restwerten dieser Biomarker basieren und die taxonomische Häufigkeit der oben genannten Taxa könnte mit diesen altersbereinigten Restwerten in Zusammenhang gebracht werden. Mit zunehmendem Alter nahm auch die Häufigkeit von Methanobrevibacter allmählich zu. Bei Mäusen wurde über den Verlust von Akkermansia bei älteren Erwachsenen und seine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Dicke des Dickdarmschleims und des entzündungshemmenden Immunstatus berichtet46. In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen könnten altersbedingte signifikant erhöhte Häufigkeiten von Methanobrevibacter, methanogenen Genen und mikrobieller Vielfalt mit einer verlängerten Dickdarmtransitzeit verbunden sein, die bei älteren Erwachsenen beobachtet wurde47,48. Methanobrevibacter reichert sich mit zunehmendem Alter allmählich an, was möglicherweise eine Rolle bei der Langlebigkeit spielt49.

Unsere Analysen ergaben, dass ältere Erwachsene, insbesondere Hundertjährige, mit zunehmendem Alter häufiger mehrere gesundheitsfördernde Funktionen aufwiesen, darunter den biologischen Abbau und Stoffwechsel von Xenobiotika sowie signifikante Assoziationen mit der Oxidoreduktase. Hundertjährige sind langlebige Individuen und sind daher möglicherweise in der Vergangenheit häufig äußerem Druck ausgesetzt. Darüber hinaus verbringen diese Menschen aufgrund ihrer eingeschränkten Mobilität mehr Zeit in ihren Häusern als jüngere Menschen und sind daher stärker Schadstoffen in Innenräumen ausgesetzt. Daher lässt sich leicht spekulieren, dass ihr Mikrobiom diese Xenobiotika besser abbauen kann. Diese Exposition und Reaktion könnte die sich ansammelnde Fähigkeit zum Abbau von Xenobiotika in der Darmmikrobiota von Menschen mit langer Lebensspanne vorantreiben. Hier spekulieren wir, dass die Fähigkeit langlebiger Menschen, Xenobiotika abzubauen, das Ergebnis eines Top-Down-Auswahlprozesses sein könnte, der mit den Lebensgewohnheiten dieser besonders langlebigen Menschen zusammenhängt. Frühere Studien ergaben, dass die Darmmikrobiota italienischer Erwachsener auch Xenobiotika abbauen kann50, was eine funktionelle Reaktion auf die Exposition gegenüber diesen Verbindungen sein könnte51.

Tatsächlich können viele systemische Erkrankungen des Menschen durch die kollektive mikrobielle Zusammensetzung im Darm reguliert werden52. Diese Erkenntnis hat zu Versuchen geführt, das Mikrobiom durch den Einsatz von Probiotika therapeutisch zu modulieren. Die möglicherweise unterschiedlichen Mechanismen, durch die bestimmte Bakterien und ihre Produkte ihre unterschiedlichen positiven Wirkungen hervorrufen, sind jedoch noch unbekannt. Daher würde die Identifizierung molekularer Signalwege, die von Probiotika beeinflusst werden, einen gezielteren Einsatz von Probiotika oder die Nutzung mikrobieller kleiner Moleküle ermöglichen. Mithilfe von In-vitro-Kulturtechniken im großen Maßstab isolierten wir 2055 Stämme aus Stuhlproben und führten eine gezielte Isolierung und ein Screening eines Lactobacillus-Stamms durch. Dabei identifizierten wir L-Ascorbinsäure als ein kleines Molekül, das von LP124 abgeleitet ist, obwohl es wahrscheinlich ist, dass viele andere kleine Moleküle darin enthalten sind Reaktion auf LP124, die wir mit unserer spezifischen metabolomischen Plattform nicht identifizieren konnten. Dies legt nahe, dass die Kulturomik eine wichtige Ergänzung zur Metagenomik für ein umfassendes Verständnis der Darmmikrobiota darstellt. Obwohl die Anzahl der Stämme von Darmmikrobiota-Arten, die durch Culturomik ermittelt wurden, nicht die tatsächliche Häufigkeit jeder Art widerspiegelt, deuten die höheren Segregationsraten der Kulturomik dennoch in gewissem Maße auf die relativ höhere relative Häufigkeit dieser Art im Kot hin. Unsere Studie ergab, dass die Zahl der Lactobacillus- und Enterococcus-Stämme, die in der langlebigsten Stadt der Welt – Jiaoling, China, kultiviert werden – höher ist, was darauf hindeutet, dass diese beiden Taxa bei Hundertjährigen möglicherweise häufiger vorkommen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Literaturberichten zu metagenomischen Daten53. Durch Kulturanalysen haben wir herausgefunden, dass L. salivarius die am häufigsten vorkommende Lactobacillus-Art ist. Um die Genauigkeit der Kulturanalyse für die Lactobacillus-Isolierung sicherzustellen, analysierten wir die Klassifizierungsebene der Darmmikrobiota auf Artenebene anhand der Metagenomik und stellten fest, dass die Top-20-Arten L. mucosae, L. salivarius, L. delbrueckii und L. fermentum waren , L. rogosae, L. johnsonii, L. amylovorus, L. reuteri, L. ruminis, L. equicursoris, L. murinus, L. gasseri, L. bifermentans, L. casei, L. ceti, L. plantarum, L . Crispatus, L. iners, L. ingluviei, L. brevis. Hier ist deutlich zu erkennen, dass L. salivarius auf Artenebene an zweiter Stelle steht. Dies zeigt, dass die Häufigkeit von L. salivarius in der Darmmikrobiota sehr hoch ist, sodass es normal ist, dass wir eine große Anzahl von L. salivarius isolieren können. Dieses Ergebnis stimmt auch mit den Ergebnissen von Kristina et al. überein. bezüglich des Vorhandenseins großer Mengen von Lactobacillus im Dickdarm54. Wie wir wissen, ist die überwiegende Mehrheit der Stämme in der Darmmikrobiota nicht kultivierbar. Die metagenomische Analyse konnte keine lebensfähigen Mikroorganismen für eine weitere Stammcharakterisierung oder Funktionsbewertung liefern. Culturomics scheint in der Lage zu sein, diese Lücke zu schließen. Dies stellt eine wirksame Ergänzung zur metagenomischen Sequenzierung dar, um die mikrobielle Zusammensetzung des Darms umfassend zu charakterisieren. Derzeit weisen Kulturomik und Metagenomik ein hohes Maß an Komplementarität und ein gewisses Maß an gegenseitiger Validierung auf. Daher trägt die Kulturforschung zum besseren Verständnis der Zusammensetzung der Darmmikrobiota bei und beleuchtet mikrobielle dunkle Materie. Die Kombination von kulturomischen und metagenomischen Daten liefert Einblicke in die Struktur und Funktion von Darmbakteriengemeinschaften. Zukünftige Studien, die transkriptomische, proteomische und lipidomische Studien an Tieren untersuchen, die einer Reihe funktioneller Belastungen ausgesetzt sind, werden zu unserem umfassenden Verständnis des kausalen Zusammenhangs zwischen Darmmikrobiota und menschlicher Gesundheit und Langlebigkeit beitragen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie unser Verständnis des Zusammenhangs zwischen Darmmikrobiota und menschlicher Gesundheit und Langlebigkeit erweitert. Durch die Kombination von Metagenomik und In-vitro-Großkultur haben wir zum ersten Mal die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Darmmikrobiota einer gesunden und langlebigen Bevölkerung in Jiaoling, der langlebigsten Gemeinde der Welt, und ihren einzigartigen angereicherten Darm nachgewiesen Mikroben. Darüber hinaus stellen wir fest, dass Lactobacillus ein starker Motor für die menschliche Gesundheit ist und belegen in der Literatur maßgeblich sein Potenzial als Antioxidans. Diese Daten deuten auch darauf hin, dass die Darmmikrobiota zusätzlich zu ihrer intrinsisch kodierten spezifischen biokatalytischen Aktivität Bioverarbeitungswege des Wirts induzieren kann, die möglicherweise Auswirkungen auf aufgenommene Fremdorganismen haben. Um altersbedingte Verläufe der Darmmikrobiota sowie generationsbedingte Unterschiede aufzuklären, die nicht in Querschnittsdaten erfasst werden können, sind weitere kontrollierte Längsschnittstudien am Menschen über einen breiten Altersbereich hinweg erforderlich.

Die allgemeinen Forschungsziele der Jiaoling-Kohorte (Gemeinde der Welt für Langlebigkeit, Kreis Jiaoling, Stadt Meizhou, Provinz Guangdong, China) bestehen darin, zu untersuchen, wie sich die Darmmikrobiota im Verhältnis zum Alter verändert und wie sich dies auf die Gesundheit auswirken kann. Die Studie wurde von der Ethikkommission des First Affiliated Hospital/School of Clinical Medicine der Guangdong Pharmaceutical University genehmigt. Das erste angegliederte Krankenhaus/Schule für klinische Medizin der Guangdong Pharmaceutical University: 2021(13).

Basierend auf dem nationalen Personenstandsmeldesystem wurden insgesamt 247 Teilnehmer aus acht Städten zufällig ausgewählt. Die Teilnehmer waren aufgrund der folgenden Kriterien teilnahmeberechtigt: (1) in Jiaoling geboren; (2) 5 Jahre oder länger ununterbrochener Aufenthalt in Jiaoling, ausgehend vom Probenahmepunkt; (3) im Alter von 0–110 Jahren. Alle eingeschriebenen Teilnehmer unterzeichneten vor ihrer körperlichen Untersuchung und Biomaterialentnahme eine Einverständniserklärung. Anschließend wurden 247 Teilnehmer, die die folgenden zusätzlichen Kriterien erfüllten, für die metagenomische Studie ausgewählt: (1) mit Stuhl- und Blutproben; (2) ohne Antibiotikabehandlung im letzten Monat vor der Biomaterialsammlung; (3) ohne schwere Erkrankungen (Krebs im Endstadium, Nieren- oder Lebererkrankung). Von jedem Probanden wurden Stuhlproben frisch entnommen und sofort bei –20 °C eingefroren, auf einem Eisbeutel ins Labor transportiert und bis zur Analyse in einem Kühlschrank mit –80 °C gelagert. Für altersbezogene Gruppenvergleichsanalysen haben wir Probanden aus der Jiaoling-Kohorte in sechs Altersgruppen eingeteilt, wobei ein Cutoff von 20 Jahren verwendet wurde. Klinische Maße, Größe, Gewicht und Taillenumfang wurden von geschultem Personal nach standardisierten Protokollen gemessen. Die abgeleiteten anthropometrischen Parameter einschließlich des BMI (kg/m2) wurden berechnet und für weitere Analysen gespeichert. Der Blutdruck (mm Hg) wurde dreimal mit einem automatischen Manometer gemessen und der Mittelwert der Messungen wurde in die Analyse einbezogen. Die Statistiken der Faktoren sind in Tabelle 1, Tabelle S1 und Abb. 3 zusammengefasst.

Mikrobielle DNA wurde mit dem QIAamp DNA-Stuhl-Mini-Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) mit zusätzlichen Schritten des Perlenschlagens und Erhitzens unter Verwendung von Standardmethoden extrahiert55. Mit Cutadapt (v1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)56 zum Schneiden und Filtern von Lesevorgängen wurden durchschnittlich 85.170 Lesevorgänge pro Probe gemessen; Nach der Qualitätskontrolle (https://github.com/torognes/vsearch/)57 wurden durchschnittlich 80.024 saubere Lesevorgänge58 erhalten und die Effizienz der Qualitätskontrolle erreichte 94,01 %. Die Uparse-Software (v7.0.1001, http://www.drive5.com/uparse/)59 wurde verwendet, um Sequenzen in operative taxonomische Einheiten (OTUs) zu gruppieren, und es wurden 3.436 OTUs erhalten. Anschließend verwendeten wir die Mothur-Methode und die SSUrRNA60, Datenbank von SILVA132 (http://www.arb-silva.de/)61, für die Artenannotationsanalyse der OTUs (Schwellenwert auf 0,8–1 eingestellt). Zur Berechnung des Shannon-Index der Community-Diversität wurde die QIIME-Software (v1.9.1) verwendet. Die Diagramme der Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) wurden mit der R-Software (v2.15.3) mit den Softwarepaketen WGCNA, stats und ggplot2 erstellt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen der Alpha-Diversität und des Beta-Diversitätsindex wurden mit R-Software analysiert. Zur Erklärung der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde eine lineare Diskriminanzanalyse-Effektgröße (LEfSe) durchgeführt62. Graphviz-2.38.0 wurde zum Zeichnen des Kookkurrenz-Netzwerkdiagramms verwendet. Wir haben die DIAMOND-Software63,64 verwendet, um allgemeine funktionale Datenbankanmerkungen für nicht redundante Gensätze (E-Wert ≤ 10–5) durchzuführen. Insgesamt wurden 3.264.476 (60,85 %) ORFs mit der KEGG-Datenbank65,66, 3.204.116 (59,72 %) ORFs mit der eggNOG-Datenbank67 und 165.799 (3,09 %) ORFs mit der CAZy-Datenbank68 verglichen.

Alle Proben wurden auf MRS-Agarplatten (De Man, Rogosa, Sharpe) kultiviert und 24 Stunden lang bei 37 ° C mit aerober und anaerober Kultur inkubiert. Aus jeder Probe wurden acht bis zehn verdächtige Kolonien mit typischer Morphologie zur Identifizierung ausgewählt. Wir haben 2055 Isolate aus Stuhlproben erhalten. Nach der Identifizierung der Isolate mittels MALDI-TOF MS (Biomerieux, Frankreich) oder molekularer 16S-Identifizierung zählten wir schließlich Lactobacillus 548, Enterococcus 424, Weissella 292, Escherichia 378, Lactococcus 110, Pediococcus 92, Streptococcus 55, Klebsiella 34 usw. Es waren 185 Stämme Zu den zufällig ausgewählten, anhand von Antioxidationsindikatoren zu untersuchenden Indikatoren gehörten die Abfangraten von 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)69, die reduzierenden Aktivitäten des L-Cystein-Äquivalents (μmol/L)70 und die Abfangraten von freien Hydroxylradikalen (·OH). 71, Chelatisierungsraten von Eisenionen (Fe2+)72, Abfangraten von Superoxidanionen (O2−)73 und Hemmung der Lipidperoxidation74 bei vorläufigem Screening (Bakteriensuspension), das Gleiche gilt bei erneutem Screening (Bakteriensuspension, extrazelluläre Substanz, intrazellulär). Substanz, Bakterienfragment).

Herstellung einer Bakteriensuspension, einer extrazellulären Substanz, einer intrazellulären Substanz und eines Bakterienfragments. Die durch Selbstisolierung erhaltenen Laktobazillen wurden in 1,5 ml MRS-Flüssigmedium inokuliert, 24 Stunden lang bei 37 °C als Inokulum kultiviert und in 50 ml MRS-Flüssigmedium mit 2 % Inokulum inokuliert und 24 Stunden lang kultiviert. Dadurch erhält man die Kulturlösung des Stammes. Zentrifuge bei 10.000 U/min für 10 Minuten bei 4 °C. Der Überstand ist die extrazelluläre Substanz. Sammeln Sie 10–15 ml in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Resuspendieren Sie die Zellen mit steriler Kochsalzlösung, stellen Sie die Zelldichte auf 109 KBE/ml und OD600 = 1,0 ± 0,1 ein, was der Bakteriensuspension entspricht; Nehmen Sie mindestens 3 ml bis 15 ml Zentrifugenröhrchen und beschallen Sie sie im Eisbad (750 W, Pause für 5 s, intermittierend für 5 s, Arbeitszeit 7,5 min, Gesamtzeit 15 min), zentrifugieren Sie bei 10.000 U/min für 25 Min. bei 4 °C, den Überstand als intrazelluläre Substanz sammeln; Sammeln Sie den Niederschlag und geben Sie das entsprechende Volumen normaler Kochsalzlösung hinzu, bei der es sich um das Bakterienfragment handelt.

Die Vorbereitungen für die Sequenzierungsbibliothek der nächsten Generation wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers erstellt. Für jede Probe wurden 200 ng genomische DNA durch Ultraschallbehandlung (Covaris S220) zufällig auf <500 bp fragmentiert. Die Fragmente wurden mit End Prep Enzyme Mix zur Endreparatur, 5'-Phosphorylierung und dA-Tailing in einer Reaktion behandelt, gefolgt von einer TA-Ligation, um Adapter an beide Enden hinzuzufügen. Anschließend wurde die Größenauswahl der mit dem Adaptor ligierten DNA mithilfe von Beads durchgeführt, und es wurden Fragmente von etwa 470 bp (mit einer ungefähren Insertgröße von 350 bp) gewonnen. Die PCR-Produkte wurden mit Beads gereinigt, mit einem Qsep100 (Bioptic, Taiwan, China) validiert und mit dem Qubit3.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) quantifiziert.

Anschließend wurden Bibliotheken mit unterschiedlichen Indizes gemultiplext und gemäß den Anweisungen des Herstellers (Illumina, San Diego, CA, USA) auf ein Illumina HiSeq/Novaseq-Gerät oder gemäß den Anweisungen des Herstellers (MGI, Shenzhen, China) auf ein MGI2000-Gerät geladen. Für Pacbio wurde genomische DNA geschert und anschließend 10-kb-doppelsträngige DNA-Fragmente ausgewählt. DNA-Fragmente wurden an den Enden repariert und mit universellen Haarnadeladaptern ligiert. Nachfolgende Schritte wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Vorbereitung der SMRTbell-Bibliothek befolgt. Die Bibliothek wurde im PacBio SEQUEL-Instrument75 sequenziert.

PacBio-Lesevorgänge wurden mit HGAP4/Falcon von WGS-Assembler 8.276,77,78,79,80,81 zusammengestellt. Und dann korrigieren wir das Genom mit der Software Pilon unter Verwendung früherer Illumina-Daten oder Quiver unter Verwendung von Pacbio-Reads. Die Gensuchsoftware Prodigal82/Augustus83 wurde zum Auffinden kodierender Gene verwendet. Die kodierenden Gene wurden von BLAST mit der NR-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) annotiert. Anschließend wurden die Funktionen der Gene mit der Datenbank GO84 (Gene Ontology) annotiert, und die Pfade wurden mit der Datenbank KEGG85 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) annotiert.

Alle vollständigen, geschlossenen Genomsequenzen, die in der GenBank für Lactobacillus plantarum verfügbar sind, wurden heruntergeladen und in die Analyse zur Generierung der Spezies-Pangenome einbezogen86. Basierend auf dieser Analyse wurde eine Liste einzigartiger Gene für jede Art erstellt, das heißt, sie sind bei einer Art vorhanden und bei der anderen nicht vorhanden. Um die Spezifität dieser Gene zu bestätigen, wurde eine Suche nach den einzigartigen Genen durchgeführt, die für jede Art aufgeführt sind. Erstens gegen alle Genome von Lactobacillus plantarum und zweitens gegen die NCBI-Datenbank für Prokaryoten. Zur Validierung der vorgeschlagenen einzigartigen Gene als Artenbiomarker wurden 227 isolierte Stämme von Lactobacillus und Nicht-Lactobacillus mittels PCR auf das Vorhandensein der einzigartigen Genmarker untersucht, die anhand der Pangenomanalyse bestimmt wurden (Tabelle S7).

Institut für Mikrobiologie, Guangdong-Akademie der Wissenschaften, Genehmigungsnummer für Tierversuchsethik: GT-IACUC201909026. Kunming-Mäuse (SPF-Klasse) wurden von der Southern Medical University (Guangdong, China) bezogen und in den gnotobiotischen Einrichtungen in einem 12-stündigen Hell/Dunkel-Zyklus gehalten. Alle Mäuse wurden ad libitum mit sterilem Futter und Wasser gefüttert. Die Kontrollgruppe erhielt eine subkutane Injektion normaler Kochsalzlösung (200 mg/kg/Tag) und täglich wurden 0,2 ml normaler Kochsalzlösung per Magensonde verabreicht. Der Modellgruppe wurde D-Galaktose (200 mg/kg/Tag) subkutan injiziert, und täglich wurden 0,2 ml normale Kochsalzlösung per Magensonde verabreicht. Der Testgruppe wurde D-Galactose (200 mg/kg/Tag) subkutan injiziert und täglich wurden 0,2 ml einer 1,01 ± 0,05 × 109 KBE/ml A/B-Bakterienlösung per Magensonde verabreicht. Stamm A bestand aus Lactobacillus plantarum 124 (Teststamm) und Stamm B bestand aus dem Akkermansia muciniphila-Stamm ATCC BAA-835 (Kontrollstamm). Die positive Medikamenten-Vc-Gruppe erhielt D-Galactose (200 mg/kg/Tag) subkutan injiziert, und das Antioxidans Vc (200 mg/kg/Tag) wurde täglich per Sonde verabreicht. Der Fütterungszyklus betrug 9 Wochen. Leber- und Nierengewebehomogenate wurden für die Analyse auf oxidative Stressmarker wie Glutathionperoxidase (GSH-Px), Superoxiddismutase (SOD), Thioredoxinreduktase (TrxR), Gesamtantioxidationskapazitätswerte (T-AOC), Malondialdehyd (MDA) vorbereitet. Carbonyl und Endotoxin (ET).

Nachdem ein Tier getötet wurde, wurden seine Leber, seine Niere und sein Dünndarm isoliert. Die Gewebe und Organe wurden mit 10 % Formalin fixiert, in herkömmliches Paraffin eingebettet, auf eine Dicke von 4–5 μm geschnitten, mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt und die Ergebnisse von Pathologen gelesen. Die Schnitte wurden nach dem Schweregrad der Läsion beurteilt: leicht (+), mittelschwer (++), schwer (+++) und kein erkranktes Gewebe (−).

Die Gesamt-RNA wurde mit einem RNeasy Mini-Kit (Huangshi Yanke Biotechnology Co., LTD, Hubei, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus Leber und Niere von Mäusen extrahiert. Quantitative RT-PCR wurde unter Verwendung von SYBR Premix Ex Taq (Huangshi Yanke Biotechnology Co., LTD, Hubei, China) mit dem Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System durchgeführt. Die Berechnung der mRNA-Expression erfolgte mit der 2−ΔΔCT-Methode unter Verwendung des geometrischen Mittelwerts der Housekeeping-Gene GSH-Px, SOD, TrxR und Nuclear Factor-Erythroid 2-Related Factor 2 (Nrf2). Die Gene und Primersequenzen sind in Tabelle S8 aufgeführt. Vergleiche zwischen Gruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit n = 6–9 pro Gruppe durchgeführt. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung der biologischen Replikate dargestellt.

Serumproben wurden von Modell- und LP-Tieren (n = 6 pro Gruppe) gesammelt, Acetonitril wurde verwendet, um Metaboliten durch Proteinfällung zu extrahieren. Die ungezielte Metabolomik-Profilierung wurde mittels Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit einem Thermo Scientific High-Field Qexactive-Massenspektrometer (HILIC/ESI+, C18/ESI-, 85–1.275 m/z, 120k Auflösung) durchgeführt. Spektralmerkmale (m/z, Retentionszeit), die identifizierten und nicht charakterisierten Metaboliten entsprechen, wurden mithilfe der apLCMS/xMSanalyzer-Software integriert und ausgerichtet. Metaboanalyst87 wurde für die statistische Analyse und Mummichog-Software88 für die Signalweganreicherungsanalyse verwendet und anhand authentifizierter Standards anhand von Retentionszeit, m/z und MS/MS verifiziert. Kandidatenmoleküle wurden nach Ionendissoziationsexperimenten auf einem Thermo Scientific Fusion-Massenspektrometer identifiziert und die Spektralbibliothek wurde mit Compound Discoverer 3.0 mit der mzCloud-, mzVault- und MassList-Bibliothek abgeglichen.

Den unterschiedlichen Daten zufolge wurde eine statistische Analyse zwischen den Gruppen mithilfe des Wilcoxon-Rangsummentests, des Student-t-Tests oder einer einfaktoriellen ANOVA-Varianzanalyse durchgeführt und als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Der Shannon-Index auf Gattungsebene wurde mit QIIME (v1.9.1) berechnet. R-Software (v2.15.3) wurde verwendet, um den Unterschied zwischen den Gruppen des Alpha-Diversity-Index und des Beta-Diversity-Index zu analysieren. p < 0,05 zeigt statistische Signifikanz an. Statistische Analysen und Datenvisualisierung wurden mit der R-Software (v2.15.3) mit den Softwarepaketen WGCNA, stats und ggplot2 durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Sequenzdaten für alle Proben wurden im NCBI Sequence Read Archive (SRA) unter dem Zugangscode BIOProject: PRJNA895352 hinterlegt. Weitere Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Papier und seinen ergänzenden Informationsdateien oder auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Studie wurde gemeinsam durch Forschungsstipendien des Key-Area Research and Development Program der Provinz Guangdong (2018B020205002), des Special Project for Capacity Building of Innovation Driven Development (2020GDASYL-20200301002) der Guangdong Province Academy of Sciences und eines Projekts der Abteilung unterstützt Wissenschaft und Technologie der Provinz Guangdong (2019QN01N107). Wir möchten allen danken, die an den Studien teilgenommen haben, insbesondere unseren Studienteilnehmern und Beijing Novogene Technology Co., Ltd.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lei Wu, Xinqiang Xie, Ying Li.

Schlüssellabor für mikrobielle Sicherheit und Gesundheit der Provinz Guangdong, Staatliches Schlüssellabor für angewandte Mikrobiologie Südchina, Institut für Mikrobiologie, Guangdong-Akademie der Wissenschaften, Guangzhou, Guangdong, China

Lei Wu, Xinqiang Xie, Ying Li, Tingting Liang, Haojie Zhong, Lingshuang Yang, Yu Xi, Jumei Zhang und Qingping Wu

Das erste angegliederte Krankenhaus der Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou, Guangdong, China

Lei Wu & Haojie Zhong

Fakultät für Biologie und Biotechnik, South China University of Technology, Guangzhou, Guangdong, China

Lei Wu & Haojie Zhong

Abteilung für Lebensmittelwissenschaft und -technologie, Institut für Lebensmittelsicherheit und Ernährung, Jinan-Universität, Guangzhou, Guangdong, China

Yu Ding

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QW, YD, LW und JZ haben diese Studie konzipiert und gestaltet. LW, XX, YL und TL stellten die Kohorten zusammen, sammelten die Proben und biologischen Daten. HZ überwachte die Übertragung von Proben und klinischen Metadaten und lieferte klinische Erkenntnisse. LW, LY und YX führten Experimente zur Kultivierung von Stuhlproben durch und isolierten die Extraktion genomischer DNA. LW war für Tierversuche zuständig. LW analysierte klinische Metadaten, metagenomische Shotgun-Sequenzierungsdaten, isolierte Genomsequenzierungsdaten und funktionelle metagenomische Daten. LW hat das Manuskript verfasst. LW, QW und YD haben das Manuskript überarbeitet. QW und YD überwachten das Projekt. LW, XX und YL trugen gleichermaßen bei. Alle Autoren stimmten der endgültigen Fassung des Manuskripts zu.

Korrespondenz mit Yu Ding oder Qingping Wu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 26. Mai 2022

Angenommen: 08. Dezember 2022

Veröffentlicht: 24. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00366-0

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