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Dec 12, 2023

Methoden zur Erfassung proteomischer und metabolomischer Signaturen aus Liquor und Serum gesunder Personen

Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 13339 (2022) Diesen Artikel zitieren 1176 Zugriffe 2 Zitate 1 Details zu altmetrischen Metriken Entdeckung zuverlässiger Signaturen für die empirische Diagnose von

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13339 (2022) Diesen Artikel zitieren

1176 Zugriffe

2 Zitate

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Entdeckung zuverlässiger Signaturen für die empirische Diagnose neurologischer Erkrankungen – sowohl infektiöser als auch nichtinfektiöser – bleibt bislang unerreicht. Eine der größten Herausforderungen bei solchen Studien ist das Fehlen einer umfassenden Datenbank, die repräsentativ für den Signaturhintergrund gesunder Personen ist und anhand derer ein abweichendes Ereignis beurteilt werden kann. Bei neurologischen Beeinträchtigungen und Verletzungen ist es wichtig, das normale Profil in der neuronalen (Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit) und systemischen Flüssigkeit (z. B. Blut) zu verstehen. Hier präsentieren wir die erste vergleichende multiomische menschliche Datenbank mit Signaturen aus Serum und Liquor einer Population von 30 Personen (15 Männer, 15 Frauen, 23–74 Jahre). Zusätzlich zu empirischen Signaturen haben wir auch gemeinsame Pfade zwischen Serum und Liquor zugeordnet. Zusammengenommen stellen unsere Ergebnisse eine Kohorte dar, anhand derer abweichende Signaturprofile bei Personen mit neurologischen Verletzungen/Erkrankungen beurteilt werden können – und bieten so einen Weg für eine umfassende Diagnose und Entdeckung von Therapeutika.

Beleidigungen oder Verletzungen des Körpers – wie sie durch eine Vielzahl nichtinfektiöser Erkrankungen wie neurodegenerative Erkrankungen, Schlaganfall und Kopfverletzungen durch stumpfe Gewalteinwirkung verursacht werden – verändern die normale physiologische und biochemische Funktion1,2,3,4. Die Identifizierung spezifischer Signaturmuster, die die Beleidigung oder Verletzung widerspiegeln, kann die Entwicklung empirischer Diagnostik und gezielter Therapien erleichtern5. Beispielsweise basiert die aktuelle Diagnostik bei leichten traumatischen Hirnverletzungen (SHT) auf neuropsychologischen Fragebögen und Bildgebungsstrategien zur qualitativen Identifizierung6,7. Die Wirksamkeit dieser Diagnostik wird durch die unterschiedliche Darstellung des Krankheitszustands, das verzögerte Auftreten von Symptomen, Komorbiditäten, die klinische Vorgeschichte und die unterschiedliche Langzeitdarstellung eingeschränkt, eine Einschränkung, die durch die Verfügbarkeit empirischer Diagnostik überwunden werden kann.

Die Ableitung empirischer diagnostischer Signaturen für einen bestimmten Krankheitszustand erfordert ein Verständnis der beteiligten Prozesse auf Systemebene. Die „Omics-Revolution“ hat schnellere, kostengünstigere Analysen von Genen, Proteinen und Metaboliten mit höherem Durchsatz ermöglicht und die Identifizierung neuer Ziele für eine Vielzahl von Krankheiten erleichtert8,9. Während das Genom gegenüber äußeren Umwelteinflüssen relativ widerstandsfähig ist, sind das menschliche Proteom und Metabolom anfälliger für Umwelteinflüsse und Verletzungen, was sie zu idealen Signaturen für die Entwicklung diagnostischer Verfahren macht (Abb. 1a). Multiomische Studien haben zur Identifizierung mehrerer Biomarker geführt, die mit einer Vielzahl von Krankheiten wie TBI assoziiert sind10,11,12,13. Aufgrund der intrinsischen Variabilität der beobachteten Biomarkerprofile war die weit verbreitete Entwicklung klinischer Diagnosen aus solchen Studien jedoch begrenzt. Eine der Haupteinschränkungen, die die klinische Übersetzung multiomischer Observablen behindern, besteht darin, dass es sich bei den mit einer Krankheit/Verletzung verbundenen Biomarkermustern nicht um Fälle einfacher Anwesenheit/Abwesenheit handelt, sondern sie müssen mit einer Schwellenkonzentration in der interessierenden Probe (z. B. Blut, Liquor oder Urin). Ohne eine verlässliche Basislinie unter gesunden Bedingungen ist es schwierig, diesen Schwellenwert zu bestimmen. Eine solche Basislinie sollte die Variabilität eines bestimmten Biomarkers zwischen Individuen in einer Population (z. B. Alter/Geschlecht) berücksichtigen. Darüber hinaus ist ein gemessenes Biomarkerprofil auch innerhalb eines Individuums eine „Momentaufnahme“ des aktuellen biochemischen Zustands und variiert im Laufe der Zeit als Reaktion auf äußere Einflüsse14. Die Verfügbarkeit systematischer, zuverlässiger Basissignaturprofile gesunder Personen, die die inter- und intraindividuelle Variabilität berücksichtigen, ist für die Beurteilung und Charakterisierung der krankheitsspezifischen Biomarker-Expression von entscheidender Bedeutung15. Die hier vorgestellte Arbeit soll uns in dieser Richtung einen Schritt weiterbringen.

(a) Hierarchie der „Omics“, bei der das Metabolom und das Proteom zeitlich empfindlicher auf Umwelteinflüsse wie Krankheiten und Verletzungen reagieren. (b) Schema der Probengewinnung und -verarbeitung für Proteomik (links) und Metabolomik (rechts). CSF-Proben (blaue Symbole) wurden durch Lumbalpunktion (S1–L5) und Serumproben (rote Symbole) durch Venenpunktion entnommen. Die Proteomics-Verarbeitung folgt dem linken Arbeitsablauf mit Lyophilisierung (1P), Resuspension und Solubilisierung (2P), Proteine ​​wurden an die S-Trap-Säule gebunden (3P), die fixierten Proteine ​​wurden gewaschen (4P), Proteine ​​wurden über Nacht mit Trypsin verdaut (5P). Die Peptide wurden eluiert (6P), getrocknet und für die LC-MS/MS-Analyse suspendiert (7P). Die Metabolomics-Verarbeitung folgt dem richtigen Arbeitsablauf durch Extraktion und Trennung organischer Lösungsmittel (1 M), gefolgt von Konzentration und Resuspension (2 M) für die GC-MS-Analyse (3 M). C) Aufschlüsselung nach Alter und Geschlecht der 30 CSF- und 30 Serumproben.

Das Gehirn ist das lipidreichste Organ und verbraucht etwa 20 % der gesamten Körperenergie16,17. Daher können Beleidigungen und Verletzungen des Gehirns (z. B. TBI) und die damit verbundene Störung der Blutversorgung eine Stoffwechselkrise auslösen, die, wenn sie nicht gelöst wird, die Hirnatrophie verstärken und die Ergebnisse verschlechtern kann18. Bei einer Störung gelangt der Liquor ins Blut, sodass Biomarker, die normalerweise nur im Gehirn vorkommen, aber im Blut vorkommen, Informationen über den biochemischen Status von Verletzungen und Krankheiten liefern können. Es gibt jedoch nur begrenzte umfassende Studien (der einzige derzeit von Dayon et al. veröffentlichte Bericht), in denen gleichzeitig die proteomischen und metabolomischen Profile übereinstimmender Liquor- und Serumproben bei einzelnen Patienten verglichen werden19. Solche Vergleiche werden durch die Tatsache erschwert, dass das native vergleichende multiomische Signaturprofil von Liquor und Serum bei gesunden Personen nicht genau definiert ist. Darüber hinaus ist Liquor eine hochdynamische Flüssigkeit, und die Probenentnahme kann zu unterschiedlichen Ergebnissen führen, je nachdem, ob Liquor aus der Rückenmarksflüssigkeit oder direkt über einen Shunt des Ventrikelsystems gewonnen wird20.

Hier präsentieren wir eine vergleichende proteomische und metabolomische Studie mit abgestimmtem CSF/Serum von 30 Personen ohne zuvor dokumentierte nachteilige neurologische Zustände oder Beschwerden, um einige der oben genannten Herausforderungen im Zusammenhang mit der Entdeckung von Biomarkern für neurologische Beeinträchtigungen zu lindern. Abbildung 1b zeigt detailliert die Probenentnahme und -verarbeitung von Serumproben, die vom Blut getrennt wurden, das durch Venenpunktion entnommen wurde, und Liquorproben, die durch Lumbalpunktion (L1-S1-Wirbel) entnommen wurden. Aliquote dieser übereinstimmenden Liquor-/Serumproben wurden für die Proteom- und Lipidom-Profilierung verarbeitet. Unsere Population bestand aus 15 Frauen und 15 Männern im Alter von 23 bis 74 Jahren (Abb. 1c).

Bei der Entdeckung von Biomarkern erfolgt die Depletion von Proteinen mit hoher Häufigkeit wie Immunglobulinen und Albumin (dg/L), um die Untersuchung von Proteinen mit geringerer Häufigkeit (ng/L) zu erleichtern21,22,23,24,25. In unseren ersten Scoping-Experimenten stellten wir jedoch fest, dass diese Depletionsverfahren zu einer hohen Varianz im erkannten Proteom beitrugen, sowohl bei wiederholten Messungen einer bestimmten Probe als auch zwischen ähnlichen Proben. Aus diesem Grund haben wir uns dafür entschieden, die Empfindlichkeit zu opfern, um Proteine ​​in sehr geringer Konzentration zuverlässig nachzuweisen, um die Variabilität der gemessenen Proteomprofile zu verringern. Die Proteine ​​wurden auf einer S-Trap-Säule gereinigt und verdaut und anschließend per LC-MS/MS auf einer Thermo Scientific Fusion Lumos-Plattform im Data Independent Acquisition (DIA)-Modus analysiert (Abb. 1b). Proben aus der Chromatogrammbibliothek wurden einzeln anhand von Prosit-Vorhersagedatenbanken durchsucht und unter Verwendung einer in EncyclopeDIA v.0.9.2 erstellten Referenzspektrenbibliothek für ScaffoldDIA konvertiert (Einzelheiten in den Methoden). Proteine ​​wurden mit einer Falscherkennungsrate (FDR) von 10 % und mindestens einem Peptid identifiziert.

Unter diesen Bedingungen identifizierten wir 813 Proteine ​​im Serum und 932 im Liquor. Darüber hinaus waren 801 Proteine ​​in beiden Proben vorhanden, 12 Proteine ​​kamen nur im Serum vor und 131 im Liquor. Die Intensität der Fragmentionen wurde verwendet, um die relative Häufigkeit zwischen CSF und Serum zu messen. Die Gesamtintensitätsvarianz zwischen den Proteinen der gepoolten CSF- und Serumproben wurde mithilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) zerlegt. Diese Analyse ergab, dass der größte Beitrag zur Varianz der gepoolten Probe die Probenmarkierung CSF vs. Serum ist, was 56 % der Gesamtvarianz erklärt (Abb. 2a). Im Gegensatz dazu erklärte die zweite Hauptkomponente nur einen kleinen Teil der Gesamtvarianz (2 %). Abbildung 2b zeigt die relativen Unterschiede in der mittleren Proteinhäufigkeit zwischen CSF und Serum (x-Achse) als Funktion der zugehörigen Benjamini-Hochberg-bereinigten p-Werte (y-Achse). Jeder Punkt in der Abbildung stellt eines der 801 im Liquor/Serum identifizierten Proteine ​​dar. 317 Proteine ​​waren im Liquor deutlich häufiger anzutreffen, mit einem zehnfachen oder größeren Unterschied in der Intensität. Im Vergleich dazu waren 83 Proteine ​​im Serum deutlich häufiger anzutreffen, mit einem zehnfachen oder größeren Unterschied in der Intensität. In dieser Studie zeigen wir explizit, wie eine Änderung des FDR die einzigartige Proteinabdeckung zwischen Serum und Liquor verändert (Abb. 2c, vollständige Liste in S1–S2). Die Anzahl der Proteine, die für jeden Probentyp einzigartig sind, nimmt mit steigendem FDR erheblich ab. Wir haben für diese Studie einen FDR von 10 % gewählt, da dieser ein Gleichgewicht zwischen Sensitivität und Vorhersagegenauigkeit bietet.

(a) Hauptkomponentenanalyse der Proteomikdaten Serumproteine ​​(rot) und CSF-Proteine ​​(blau), wobei jeder Punkt eine Probe ist. (b) Vulkandiagramm der Proteomikdaten, wobei der log10-Wert der Intensität jedes Proteins im Vergleich zum − log10-korrigierten p-Wert die vertikalen gestrichelten grauen Linien eine +/− zehnfache Änderung darstellt und die horizontale gestrichelte Linie p = 0,05 beträgt. (c) Tabelle, die beschreibt, wie die in die Analyse einbezogenen Proteine ​​je nach FDR-Rate variieren. (d) Hauptkomponentenanalyse von Metabolomics-Daten. (e) Vulkandiagramm der Metabolomics-Daten. (f) Heatmap der in der Analyse abgedeckten Metaboliten. Metaboliten rechts von der schwarzen Linie stellen die positiv identifizierten Metaboliten dar. rDie Skala von 0 bis 100 auf der Heatmap stellt den normalisierten Prozentsatz dar, der entweder im Liquor oder im Serum nachgewiesen wird.

Das Verständnis der grundlegenden Stoffwechselprofile unter gesunden, unverletzten Bedingungen kann dazu beitragen, die normale Beziehung der Stoffwechselsignaturen zwischen Serum und Liquor bei einem bestimmten Individuum zu untermauern. Hier beschreiben wir detailliert das erste übereinstimmende vergleichende menschliche CSF/Serum-Metabolom. Metaboliten wurden mit Methyl-tertbuylether und Methanol extrahiert, von den Proteinen getrennt und für die GC-TOF-MS-Analyse unter Verwendung eines Agilent 6890 GC und eines Pegasus III TOF MS derivatisiert (vollständige Details in den Methoden)26. Metaboliten wurden mit BinBase v 4.027,28,29 identifiziert und quantifiziert. In allen Proben wurden insgesamt 613 Metaboliten identifiziert. BinBase analysiert Daten als Funktion des FDR, daher haben wir Liquor/Serum im Hinblick auf die relative MS-Häufigkeit verglichen. Hierzu haben wir ähnliche statistische Verfahren angewendet, wie sie für identifizierte Proteine ​​beschrieben wurden (PCA- und t-Tests). Abbildung 2d zeigt die ersten beiden Hauptkomponentenkoordinaten der Proben. Ähnlich wie bei den obigen Ergebnissen erklärte die erste Hauptkomponente einen großen Teil der Gesamtvarianz (58 %). Diese Varianz schien auch größtenteils auf Unterschiede zwischen den Probentypen (CSF vs. Serum) zurückzuführen zu sein. Das zweite Hauptprinzip erklärte nur 6 % der Gesamtvarianz. 29 Metaboliten kamen im Liquor signifikant (> 10-fach) häufiger vor, während 110 Metaboliten im Serum signifikant (> 10-fach) häufiger vorkamen (Abb. 2e). Metabolomics-Datenbanken sind noch unausgereift, daher stellt die Anzahl der Metaboliten, die positiv zugeordnet werden können, nur einen kleinen Bruchteil der Gesamtzahl der nachgewiesenen Verbindungen dar. Abbildung 2f zeigt den kleinen Anteil (182) der nachgewiesenen Metaboliten, denen eine Verbindungsidentität zugeordnet werden konnte. Eine vollständige kommentierte Liste der identifizierten und BinBase-Metaboliten finden Sie in S5.

Der Einfluss von Alter und Geschlecht auf Variationen in den proteomischen und metabolomischen Profilen wurde bewertet. Zu diesem Zweck wurde eine Hauptkomponentenanalyse (an den ersten 10 Komponenten) des Proteoms und Metaboloms durchgeführt, bei der die Unterschiede zwischen Liquor und Serum, die auf jedes Individuum abgebildet wurden, bewertet wurden. Die hierarchische Gruppierung von Individuen auf Stationsebene ergab zwei Untergruppen innerhalb des CSF-Proteoms und -Metaboloms bei gesunden Individuen. Die Untersuchung der Demografie der Personen in diesen Untergruppen zeigt, dass sie sich je nach Alter unterschieden (Abb. 3a, c). Für das CSF-Proteom waren die beiden Gruppen durchschnittlich 39 bzw. 52 Jahre alt (p = 0,04), während die Gruppen für das Metabolom durchschnittlich 37 bzw. 53 Jahre alt waren (p = 0,005). Während die Zugehörigkeit zu Untergruppen im Proteom und Metabolom stark positiv miteinander verknüpft ist, gibt es Personen, deren Untergruppenzuordnung nicht übereinstimmt (Abb. 3b, d). Zu den bemerkenswerten neuronalen Proteinen, die sich je nach Alter unterscheiden, gehören Apolipoprotein E, neuronales Pentraxin-1 und Retikulon-4. Eine Tabelle mit den einzelnen Proteinen (S3) und Metaboliten (S4), die sich zwischen den Gruppen unterscheiden, finden Sie im SI.

(a) Clusterdiagramm der CSF-Proteomik. Jeder Punkt stellt ein Individuum dar, das auf den Hauptkomponenten mit Ward-hierarchischer Clusterbildung geclustert ist. Die rote Linie zeigt an, wo der Baum gefällt wurde, um Gruppen zu bilden. Längere Zweige bedeuten größere Abstände zwischen Individuengruppen. (b) Violindiagramm des Alters in Bezug auf CSF-Proteomics-Cluster. (c) Clusterdiagramm des CSF-Metaboloms. Jeder Punkt stellt ein Individuum dar, das auf den Hauptkomponenten mit hierarchischer Ward-Clusterbildung geclustert ist. Die rote Linie zeigt an, wo der Baum gefällt wurde, um Gruppen zu bilden. (d) Violindiagramm des Alters in Bezug auf CSF-Metabolomik-Cluster. (e) Kreuztabelle der CSF-Proteomik- und Metabolomik-Mitgliedschaft.

Mehrere Biomarker und physiologische Prozesse wurden mit der Pathologie neuronaler Beeinträchtigungen und Verletzungen in Verbindung gebracht. Dennoch kommen viele dieser Signaturen in gesunden Zellen zum Ausdruck – wenn auch in anderen Konzentrationen als in verletzten. In diesem Abschnitt untersuchen wir die relative Verteilung einiger dieser Signaturen in gesundem Liquor und Serum, um eine Basislinie für ihre Expression und die daraus resultierende Extrapolation der Veränderung bei Beleidigungen und Verletzungen zu ermitteln. Insbesondere vergleichen wir die MS-Intensitäten zwischen Apolipoproteinen (Abb. 4a) und wichtigen Neuroproteinen in Liquor und Serum (Abb. 4b)10,30. Apolipoproteine, insbesondere Apo-E (P02649), sind an einer Vielzahl von Erkrankungen beteiligt, darunter Herz-Kreislauf-Erkrankungen, neurodegenerative Erkrankungen und TBI31,32. In einem anderen modernen Bericht33 fanden wir keine signifikanten Unterschiede bei diesen Proteinen basierend auf dem Geschlecht der Personen. Apo-E wird in der Leber von Hepatozyten und im Gehirn produziert und ist das siebte Hauptprotein im Liquor. Tatsächlich haben wir herausgefunden, dass Apo-E in signifikanter (10-fach) höherer Häufigkeit im Liquor als im Serum exprimiert wird (Abb. 4a). Serumamyloid A1, A2 und A4 (SAA) (P0DJI8, P0DJI9, P35542) sind konstitutiv exprimierte Apolipoproteine, deren Expression sich als Reaktion auf eine Zytokin-induzierte Entzündung ändert (IL-1, IL-6, IL-8 und TNFα). Es wurde vermutet, dass diese Proteine ​​im Verlauf der TBI je nach Geschlecht und bei größeren Kohorten variieren19,34. Dementsprechend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die konstitutiven SAA-Spiegel im Serum höher sind als im Liquor, wie es bei gesunden Personen zu erwarten ist. Im Gegensatz zu anderen Erkenntnissen konnten wir jedoch keinen grundlegenden Unterschied in den SAAs zwischen Männern und Frauen feststellen. Ein weiterer Vergleich von Apo-A, Apo-B und Apo-C ergab erwartete Trends höherer Basiskonzentrationen im Serum gegenüber CSF, wo diese Proteine ​​mit Wirts-Lipoproteinen wie HDL, LDL und VLDL assoziiert sind. Weitere relevante Insult- und Verletzungsmarker (Abb. 4b), die in gesundem Liquor und Serum beobachtet werden, sind (1) die im Liquor häufiger vorkommende IL-6-Rezeptor-Untereinheit Beta (P40189) – Aktivator der JAK-MAPK- und JAK-STAT3-Signalisierung, (2 ) das IL1-Rezeptor-Zubehörprotein (Q9NPH3) – Teil des IL-33-Signalsystems, das für die prä- und postsynaptische Differenzierung von Neuronen verantwortlich ist, (3) Serum-Amyloid P (P02743) – im Zusammenhang mit Amyloidose und Aggregation in Plaques, (4) Amyloid-ähnliches Protein 1 (P51693) – Teil der postsynaptischen Funktion und Transkriptionsregulator, (5) Amyloid-Vorläuferprotein (P05067) – ein metallbindendes Protein, das unter anderem für Axiogenese, Synaptogenese, neuronales Wachstum und Adhäsion wichtig ist, und 6) γ-Enolase (P09104) – ein äußerst wichtiges neuroprotektives/neurotrophes Enzym mit einem breiten Spektrum biochemischer Funktionen, wurde ausschließlich im Liquor gefunden.

(a) Boxplots der Apolipoprotein-Intensität und Vergleich zwischen Liquor (blau) und Serum (rot). Serum-Amyloid-A-Proteine ​​(SAA#) und Apolipoproteine ​​(Apo-Buchstabe). Mit Ausnahme von Apo-E kommen Apolipoproteine ​​im Serum im Allgemeinen häufiger vor als im Liquor. (b) Boxplots wichtiger nachgewiesener Neuro- und Entzündungsproteine, Serum-Amyloid-P und P1 (SAP), Amyloid-Vorläuferprotein (ABPP), Interleukine 1 und 6 (IL-1 und IL-6), γ-Enolase (ENO2). (c) STRING-Überrepräsentationsanalyse der Axonführung. Grau markierte Proteine ​​steuern mehrere biochemische Wege und kamen in unserer Überrepräsentationsanalyse häufig vor. Weiß markierte Proteine ​​kommen im Liquor und im Serum vor, blau markierte Proteine ​​kommen nur im Liquor vor und das rot markierte Protein kommt nur im Serum vor.

Überrepräsentationspfadbasierte Analysen mit bioinformatischen Werkzeugen sind nützlich, um Muster von Proteinen zu identifizieren, die mit bekannten biochemischen Funktionen verbunden sind. Hier verwendeten wir STRING der Proteine, die mit der Axonführung FDR = 2.14E−7 (Reactome R-HSA-422475) in Liquor und Serum assoziiert sind (siehe Abb. 4c). Diese Analyse erfordert gleichzeitiges Vorkommen, gemeinsame Expression, direkte experimentelle Beweise, Text-Mining und Datenbanknachweise, um den Clustering-Satz mit der höchsten Konfidenzgrenze (0,9) zu generieren. Jeder Knoten stellt ein einzelnes Protein dar und die Linien, die die Knoten verbinden, sind zugeordnete Konfidenzlinien. Grau markierte Proteine ​​– Matrix-Metalloproteinase (MMP) 2/9 und Roundabout-Homolog 1 (ROBO1) – steuern mehrere biochemische Wege und kamen in unserer Überrepräsentationsanalyse häufig vor. Zu den im Liquor nachgewiesenen Proteinen, die in der vorliegenden Studie nicht im Serum nachgewiesen wurden, gehören: Moesin (MSN, P26038), Hauptprionprotein (PRNP, P04156), Stromazellen-abgeleiteter Faktor 1 (CXCL12, P48061), Tubulin-Alpha-1B-Kette (TUBA1B, P68363), Dreifachfunktionsdomänenprotein (TRIO, O75962), Natrium Kanaluntereinheit Beta-3 (SCN3B, Q9NY72), Plexin-B1 (PLXNB1, O43157), Netrinrezeptor (UNC5C, O95185). Von Bedeutung ist, dass viele dieser Proteine ​​mit dem Aktin-Remodelling, der Zellmigration und dem Zellwachstum verbunden sind. PLXNB1 und UNC5C sind direkt für die Axonführung verantwortlich, die für die Reparatur neuronalen Gewebes nach einem TBI35 erforderlich ist. Das einzige im Serum, aber nicht im Liquor nachgewiesene Protein ist Ezrin (EZR, P15311), ein Protein, das mit der Axonführung assoziiert ist und Komplexe mit Radixin und Moesin bildet, die Teil des Aktin-Zytoskeletts sind. Varianz in den Netzwerkverbindungen biochemischer Signalwege, beispielsweise der Axonführung, kann nützliche Informationen liefern, wenn eine Störung der Blut-Hirn-Schranke oder eine andere Dysregulation der Proteinproduktion und -funktion vorliegt.

Eine Untersuchung der relativen MS-Intensitäten der positiv zugeordneten Metaboliten ist basierend auf der biochemischen Klasse in Abb. 5 dargestellt. In diesen Diagrammen stellt jeder Punkt einen einzelnen Metaboliten dar und seine x-, y-Position ist die Intensität (0–100) im Liquor vs .Serum. Punkte in der Nähe der Diagonale y = x (gestrichelte Linie in Abb. 5) stammen von Proteinen, die in Liquor und Serum nahezu gleiche Konzentrationen aufweisen. Diese Analyse beschreibt den metabolischen und biochemischen Bedarf jeder Flüssigkeit. Beispielsweise kommen Metaboliten, die mit der Zuckersynthese und dem Zuckerstoffwechsel in Zusammenhang stehen, im Liquor häufiger vor (Abb. 5a), wohingegen Aminosäuresynthese und -stoffwechsel im Serum häufiger vorkommen (Abb. 5b). Die zirkulierenden Serumspiegel an freien Aminosäuren spiegeln die Proteinaufnahme und Muskelsynthese wider. Andererseits ist das Gehirn das stoffwechselintensivste Organ und macht 20 % des Zuckerstoffwechsels aus. Interessanterweise wurden synthetische Zucker (z. B. Xylitol, Sorbitol und Mannitol) alle in größerer Menge im Liquor als im Serum gefunden. Von den sieben positiv identifizierten Neuroregulatoren (Abb. 5c) fanden wir nur einen, der sowohl im Liquor als auch im Serum nachgewiesen wurde: 5-Methoxytryptamin und 5-Aminovaleriansäure, ein schwacher GABA-Agonist. Serotonin und Phenylethylamin wurden ausschließlich im Serum nachgewiesen, möglicherweise aufgrund der Liquorgewinnung durch Lumbalpunktion. Wir stellen auch fest, dass Neuroregulatoren rund um das Gehirn konzentriert sind (Abb. 5d). Die beiden ausschließlich im Liquor nachgewiesenen Neuroregulatoren waren N-Acetylasparaginsäure, eine modifizierte Aminosäure, die vorwiegend in Neuronen vorkommt, und der primäre Metabolit von Serotonin, 5-Hydroxy-3-indolessigsäure36. Nur im Serum fanden wir eine größere Anzahl an Lipiden und Sterinen; insbesondere Palmitoleinsäure, Linolsäure, Desoxycholsäure, Cholsäure, cis-Gondoinsäure, Arachidonsäure und Beta-Glycerinphosphat (Abb. 5e). Eine vollständige Tabelle der identifizierten Metaboliten und der relativen MS-Intensitäten finden Sie in S5.

Diagramme der Hauptklassen der identifizierten Metaboliten, Verbindungen mit größerer Häufigkeit im Serum (rote Kreise), ausschließlich im Serum (rote Dreiecke), Verbindungen mit größerer Häufigkeit im Liquor (blaue Kreise), ausschließlich im Liquor (blaue Dreiecke) und Verbindungen in gleichem Maße (innerhalb von 5 %) Häufigkeit (schwarze Kreise). Die schwarz gestrichelte diagonale Linie stellt gleiche Intensitäten dar. (a) Kohlenhydratmonomere (Zucker), die mit der Synthese und dem Stoffwechsel verbunden sind, sowie künstliche Süßstoffe. (b) Die 21 natürlichen Aminosäuren wurden alle nachgewiesen, Aminosäurederivate und Metaboliten, die mit dem Proteinabbau verbunden sind. (c) Die nachgewiesenen Neuroregulatoren befanden sich hauptsächlich im Serum oder Liquor. d) Purine, Pyrimidine und ihre Derivate, aus denen die Nukleoside in DNA und RNA bestehen. (e) Lipide mit niedrigem Molekulargewicht wurden hauptsächlich im Serum über Liquor nachgewiesen. (f) Andere Metaboliten, darunter Produkte des Harnstoffkreislaufs sowie Nahrungsmittel- und Arzneimittelmetaboliten.

Durch die Zuordnung biochemischer Pfade zu Listen von Proteinen und Metaboliten werden aktive/inaktive biologische Funktionen sichtbar, die zur Beurteilung des Krankheitszustands eines Individuums herangezogen werden können. Hier ordnen wir in unserer Normalbevölkerung die häufigsten Signalwegklassen, die durch eine Überrepräsentationsanalyse gefunden wurden, unserer „normalen“ Bevölkerung zu (Tabelle 1). Diese Ergebnisse wurden aus der Verwendung von Reactome für unsere Datensätze abgeleitet, da wir fanden, dass dies das anschaulichste Werkzeug für die normale biochemische Funktion ist. Bei den nicht normalen Stoffwechselfunktionen stellten wir fest, dass die Aktivierung und Degranulation von Blutplättchen wahrscheinlich mit der Probenentnahme aus den Lumbal- und Venenpunktionsverfahren zusammenhängt. Die Analyse identifiziert viele der erwarteten normalen biochemischen Wege, einschließlich der Organisation der extrazellulären Matrix, der Hämostase, des Immunsystems, des Proteinstoffwechsels und des durch Vesikel vermittelten Transports (Tabelle 1). Alle hier dargestellten Wege sind mit löslichen Proteinen/Metaboliten im Serum und Liquor verbunden, da die Zellen vor der proteomischen und metabolomischen Profilierung entfernt wurden. Bemerkenswert ist, dass unsere positiv identifizierten Metaboliten recht niedrig waren (wie üblich), weshalb wir nur eine begrenzte überlappende Abdeckung mit unseren im Proteom identifizierten Signalwegen erhalten. Die vollständige Tabelle der assoziierten Pfade von nachgewiesenen Proteinen (Serum S6 und CSF S7) und Metaboliten (Serum S8 und CSF S9), aus denen diese Tabelle besteht, finden Sie im SI.

Die Entwicklung neuer Therapeutika und Diagnostika für neurologische Beeinträchtigungen und Verletzungen erfordert sowohl die Identifizierung spezifischer Biomarker als auch die damit verbundene Quantifizierung normaler und abnormaler Konzentrationen, um Schwellenwerte für die Krankheitserkennung zu bestimmen. Das Aufkommen neuer Omic-Tools hat bei ersteren zu Innovationen geführt, letzteres erfordert jedoch eine Untersuchung verschiedener Stichprobentypen. Darüber hinaus haben sich mit der Weiterentwicklung unseres Verständnisses der Pathophysiologie von Krankheiten Biomarker-Panels als aussagekräftigere diagnostische Messungen gegenüber einzelnen diagnostischen Zielen herausgestellt. Hier präsentieren wir proteomische und metabolomische Analysen von 60 Proben, 30 Liquorproben und 30 Seren von Personen ohne Vorerkrankungen. Mit dieser Analyse möchten wir so transparent wie möglich sein und unseren vollständigen Datensatz identifizierter Proteine ​​und Metaboliten (SI) anbieten, damit andere Forscher von einem vollständigen Kontrollvergleich profitieren können. Diese proteomischen und metabolomischen Profile können als Kontrollsatz für andere ähnliche „Omic“-Studien, zum Vergleich mit vorhandenen Datensätzen oder zur Festlegung zukünftiger Biomarker-Entdeckungsbemühungen verwendet werden – insbesondere mit den häufigen Markern, die an TBI beteiligt sind (z. B. Apolipoproteine). Darüber hinaus hoffen wir, andere bei der Auswahl des FDR der DIA-Proteomik unter sorgfältiger Abwägung der Balance zwischen Inklusivität und Präzision zu unterstützen. Nach unserem Kenntnisstand ist dies der erste Vergleich sowohl des Metaboloms als auch des Proteoms zwischen Liquor und Serum. In unseren demografischen Analysen konnten wir keine signifikanten geschlechtsspezifischen Unterschiede zwischen Metabolom und Proteom feststellen. Allerdings fanden wir sowohl im Metabolom als auch im Proteom zwei signifikante Gruppen basierend auf dem Alter, die Auswirkungen auf die nachgelagerte diagnostische Entwicklung haben.

Die Proteinidentifizierung hing stark vom FDR-Spiegel ab. Es besteht ein positiver Zusammenhang zwischen der Empfindlichkeit des Verfahrens (Wahrscheinlichkeit, ein Protein zu identifizieren, das in der Probe enthalten ist) und dem FDR (Wahrscheinlichkeit, dass das identifizierte Protein nicht in der Probe enthalten ist). Da wir die Proteinidentifizierung als Vorverarbeitungsschritt verwenden, um das Rauschen in unseren Messungen zu reduzieren, sind wir bereit, inklusiv zu sein, was bedeutet, dass wir einen nicht vernachlässigbaren FDR verwenden. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung eines FDR von 10 % für die meisten Analysen einen guten Kompromiss zwischen den beiden Fehlerarten darstellt und mit anderen Berichten zur ungezielten DIA-Proteomik übereinstimmt37. Wir waren nur begrenzt in der Lage, Proteine ​​mit sehr geringer Häufigkeit zu identifizieren, da wir uns aufgrund der Fehler und Unreproduzierbarkeit dieser Depletionsverfahren in unseren Händen entschieden hatten, Albumin und IgGs nicht abzubauen. Mehrere Faktoren können die gemessene Intensität und proportionale Konzentration der nachgewiesenen Proteine ​​in Serum und Liquor beeinflussen. In den meisten Arbeiten gingen wir davon aus, dass spezifische Proteinintensitäten nicht wesentlich durch Probenmatrixeffekte beeinflusst werden. Die Angemessenheit dieser Annahme hängt davon ab, dass die Proteinkonzentrationen innerhalb des linearen Quantifizierungsbereichs des Instruments liegen. Die Identifizierung von Metabolomen ist grundsätzlich auf die Empfindlichkeit der BinBase-Analysen von GC-MS/MS beschränkt. Die Ergebnisse der BinBase-Identifizierung erwiesen sich jedoch als ähnlich zu denen, die andere Identifizierungsmethoden verwendeten38. Das für die Metabolomik verwendete Protokoll normalisierte sich auf die Summenpeakhöhe aller strukturell annotierten Verbindungen der jeweiligen Probenmatrix.

Um das Metabolom und Proteom zu kontextualisieren, analysierten wir die biochemischen Pfade mithilfe einer Kombination aus Reactome, STRING und KEGG39,40,41. Die 216 positiv zugeordneten Metaboliten, Primär- und Sekundärmetaboliten, wurden basierend auf KEGG und BinBase zugeordnet. Die 813 Serum- und 932 CSF-Proteine ​​wurden biochemischen Pfaden zwischen Reactome und STRING zugeordnet. Wir fanden nur eine geringfügige Signalwegüberlappung zwischen dem Metabolom und dem Proteom, hauptsächlich aufgrund der Tatsache, dass wir nach extrazellulären Proteinen suchten, von denen nur wenige intrinsisch an den Primär-/Sekundärstoffwechsel gebunden sind. Wir haben versucht, unsere Datensätze mit PANTHER und DAVID zu analysieren; Allerdings ordneten diese Tools Krankheitszustände unserer bekannten gesunden Bevölkerung zu, hauptsächlich aufgrund der Art und Weise, wie ihre bioinformatischen Bibliotheken aufgebaut sind. Während ontologische Aufgaben aufgrund der Einschränkungen bioinformatischer Bibliotheken immer eine Herausforderung darstellen, haben wir darauf geachtet, unsere gesunde Patentpopulation zu kontextualisieren. Insgesamt präsentieren wir eine vergleichende Kohorte des Proteoms und Metaboloms von 30 Personen. Diese Daten sind ein Beitrag zur Entwicklung diagnostischer/therapeutischer Ziele für Verletzungen/Beleidigungen des Gehirns.

Insgesamt 30 gepaarte Liquor- und Humanserumproben (60 biologische Proben) von 30 gesunden Personen wurden von PrecisionMed Inc. (Solana Beach, CA) erworben. Die Gruppe bestand aus 15 Männern und 15 Frauen im Alter von 23 bis 74 Jahren. Alle Probanden waren Kaukasier (europäischer Abstammung) und absolvierten im Rahmen der Aufnahme das Mini International Neuropsychaiactric Interview (MINI PLUS). Ausführliche Informationen zu den Einschluss-/Ausschlusskriterien finden Sie in Tabelle S10. Blutproben wurden durch Venenpunktion entnommen und in sterilen Röhrchen gesammelt; Das Serum wurde hergestellt, indem man das Blut 15–30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen ließ, damit es gerinnen konnte. Das geronnene Blut wurde 10 Minuten lang bei ~ 1500 × g zentrifugiert und das Serum aliquotiert und bei –80 °C gelagert. Zur Sammlung von Liquor cerebrospinalis wurde der Lendenbereich der Wirbelsäule mit 2 % Lidocain subkutan anästhesiert. Die Lumbalpunktion wurde entweder mit einer Quincketype- oder Sprotte-Side-Hole-22G-3,5-Zoll-Nadel durchgeführt. Die Abschrägung wurde in einer Linie mit der cephalocaudalen Achse der Dura platziert, um ein Reißen der Dura zu minimieren. Die Nadel wurde zwischen den hinteren Dornfortsätzen von L5–S1, L4–L5, L3–L4 oder L2–L3 platziert und sobald Flüssigkeit sichtbar war, wurde der Öffnungsdruck mit einem sterilen Manometer gemessen. CSF wurde gesammelt, aliquotiert und bei –80 °C gelagert. Alle Proben wurden mit Eppendorf™ LowBind-Mikrozentrifugenröhrchen und sauberen und sterilen Eppendor Dualfilter TIPS PCR-Pipettenspitzen gehandhabt. Ameisensäure in LCMS-Qualität, Wasser in LCMS-Qualität und Acetonitril in LCMS-Qualität wurden von Sigma Aldrich bezogen. Lipidomanalysen wurden auf einem Agilent 6890 GC durchgeführt, der mit Gerstel CIS4 (mit dualem MPS-Injektor) und einem Pegasus III TOF MS ausgestattet war. Proteomanalysen wurden mit einem Thermo Scientific Fusion Lumos-Massenspektrometer im DIA-Modus durchgeführt.

Probenvorbereitungsprotokoll: 100 ml CSF oder Serum wurden in flüssigem N2 in salzhaltigen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung eingefroren und bis zur Trockne lyophilisiert. Die Proben wurden auf Eis zur Probenverarbeitung und MS-Analyse an den Proteomics-Kern der UC Davis (Davis, CA) geschickt. Diese Methoden wurden aus allgemeinen Protokollen des UC Davis Proteomics Core42 übernommen.

Gefriergetrocknetes Serum und CSF wurden mit 5 % SDS und 50 mM Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) bei pH 7,55 rehydratisiert. Die Proteinkonzentration wurde durch BCA-Assay (Abb. S3) und (Pierce) bestimmt, 150 μg Serum wurden auf einer S-Trap Mini Spin Digestion-Säule verdaut und 50 μg CSF wurden auf einer S-Trap Micro Spin Digestion-Säule verdaut. Zunächst wurden 10 mM Dithiothreitol (DTT) zugegeben und 10 Minuten bei 50 °C inkubiert und 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen gelassen. Als nächstes wurden 5 mM Iodacetamid (IAA) zugegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Proben wurden mit 12 %iger Phosphorsäure angesäuert, gefolgt von der Zugabe von 2,348 ml S-Trap-Puffer (90 % Methanol, 100 mM TEAB, pH 7,1) und sofort gemischt. Die gesamte angesäuerte Lysat/St-Puffer-Mischung wurde auf die S-Trap-Spin-Säule übertragen und 1 Minute lang bei 3000 rcf zentrifugiert, oder bis die gesamte Lösung durch die Säule lief. Die Säulen wurden mit 600 μl S-Trap-Puffer gewaschen und bei 2000 rcf zentrifugiert, bis sie trocken waren. Die Säulen wurden in ein sauberes Elutionsröhrchen überführt. Der Trypsin-Enzym-Verdauungspuffer wurde vorsichtig (1:25 Enzym: Gesamtprotein in 121 μl 50 mM TEAB, pH 8,0) zur Säule gegeben und bei 37 °C inkubiert. Nach der ersten Stunde wurde der Trypsin-Zugabeschritt wiederholt und der Verdau über Nacht fortgesetzt. Zu den Peptidelutionsschritten gehörten 80 μl 50 mM TEAB (pH 8,0), gefolgt von einer 1-minütigen Zentrifugation bei 1000 rcf, 80 μl 0,5 % Ameisensäure, gefolgt von einer 1-minütigen Zentrifugation bei 1000 rcf, wobei 80 μl der Lösung 50 % Acetonitril enthielten und 0,5 % Ameisensäure, gefolgt von einer 1-minütigen Zentrifugation bei 4000 rcf. Die endgültige gepoolte Elution wurde im Hochgeschwindigkeitsvakuum getrocknet. Die Peptide wurden in 0,1 % TFA, 2 % ACN resuspendiert und unter Verwendung des Pierce Quantitative Fluormetric Peptide Assay (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert. Gleiche Anteile aller Proben, basierend auf dem Fluorometrischen Peptid-Assay, wurden zusammengemischt, um eine Referenzprobe zu erhalten, die sechsmal für Chromatogramm-Bibliotheksläufe verwendet werden konnte.

Die Peptide wurden entsalzt und auf einer Thermo PepMap-Falle eingefangen und auf einer Easy-spray 100 μm × 25 cm C18-Säule unter Verwendung einer Dionex Ultimate 3000 nUPLC bei 200 nL/min getrennt. Lösungsmittel A = 0,1 % Ameisensäure, Lösungsmittel B = 100 % Acetonitril 0,1 % Ameisensäure. Gradientenbedingungen = 2 % B bis 50 % B über 60 Minuten, gefolgt von 50–99 % B in 6 Minuten und dann 3 Minuten lang gehalten, dann 99 % B bis 2 % B in 2 Minuten und Gesamtlaufzeit von 90 Minuten Thermo Scientific Fusion Lumos-Massenspektrometer im DIA-Modus. Injektionen in die Sechs-Gasphasen-fraktionierte (GPF) Chromatogrammbibliothek wurden unter Verwendung gestaffelter 4-Da-Isolierungsfenster durchgeführt. GPF1 = 400–500 m/z, GPF2 = 500–600 m/z, GPF3 = 600–700 m/z, GPF4 = 700–800 m/z, GPF5 = 800–900 m/z, GPF6 = 900–1000 m/z wurden Massenspektren mit einer Kollisionsenergie von 35, einer Auflösung von 30 K, einer maximalen Injektionszeit von 54 ms und einem AGC-Ziel von 50 K aufgenommen.

Jede einzelne Probe wurde im DIA-Modus mit denselben Einstellungen wie die Chromatogrammbibliotheksläufe ausgeführt, außer dass gestaffelte Isolationsfenster von 12 Da im m/z-Bereich von 400–1000 m/z verwendet wurden. DIA-Daten wurden mit Scaffold DIA v.2.0.0 (Proteome Software, Portland, OR, USA) analysiert. Rohdatendateien wurden mit ProteoWizard v.3.0.1174843 in das mzML-Format konvertiert. Gesamtionenchromatogramme finden Sie in S10 für Liquor und S11 für Serum.

Die Referenzspektrenbibliothek wurde von EncyclopeDIA v.0.9.2 erstellt. Die Proben der Chromatogrammbibliothek wurden einzeln anhand von Prosit-Vorhersagedatenbanken durchsucht, die mit dem Prosit-Onlineserver (https://www.proteomicsdb.org/prosit/) erstellt und mit den Encyclopedia-Tools44 für ScaffoldDIA konvertiert wurden. Die Eingabe für die Prosit-Vorhersage bestand aus dem Uniprot-Proteom UP000005640 (Homo sapiens) und 114 gängigen Laborkontaminanten (https://www.thegpm.org/crap/) mit einer Peptid-Massentoleranz von 10,0 ppm und einer Fragment-Massentoleranz von 10,0 ppm . Berücksichtigte variable Modifikationen waren: Oxidation von Methionin und Carbamidomethyl von Cystein. Es wurde angenommen, dass es sich bei dem Verdauungsenzym um Trypsin handelte, wobei maximal eine fehlende Spaltstelle(n) zulässig war. Es wurden nur Peptide mit Ladungen im Bereich [2‥3] und einer Länge im Bereich [6‥30] berücksichtigt. Die bei jeder Suche identifizierten Peptide wurden mit Percolator 3.01.nightly-13-655e4c7-dirty gefiltert, um einen maximalen FDR von 0,0145,46 zu erreichen. Einzelne Suchergebnisse wurden kombiniert und die Peptide erneut auf einen FDR-Schwellenwert von 0,01 gefiltert, um sie in die Referenzbibliothek aufzunehmen.

Die analytischen Proben wurden anhand der Retentionszeiten abgeglichen und einzeln anhand der Chromatogrammbibliothek durchsucht, die aus den oben beschriebenen fraktionierten Läufen mit sechs Gasphasen mit einer Peptidmassentoleranz von 10,0 ppm und einer Fragmentmassentoleranz von 10,0 ppm erstellt wurde. Berücksichtigte variable Modifikationen waren: Oxidation von Methionin und Carbamidomethyl von Cystein. Es wurde angenommen, dass es sich bei dem Verdauungsenzym um Trypsin handelte, wobei maximal eine fehlende Spaltstelle(n) zulässig war. Es wurden nur Peptide mit Ladungen im Bereich [2‥3] und einer Länge im Bereich [6‥30] berücksichtigt. Die in jeder Probe identifizierten Peptide wurden mit einem Perkolator (3.01.nightly-13-655e4c7-dirty) gefiltert, um einen maximalen FDR von 0,0145,46,47 zu erreichen. Einzelne Suchergebnisse wurden kombiniert und den Peptididentifikationen wurden Posterior-Fehlerwahrscheinlichkeiten zugewiesen und durch Percolator (3.01.nightly-13-655e4c7-dirty) auf einen FDR-Schwellenwert von 0,01 gefiltert.

Die Peptidquantifizierung wurde mit EncyclopeDIA v. 0.9.2 durchgeführt. Für jedes Peptid wurden die fünf Fragmentionen höchster Qualität zur Quantifizierung ausgewählt. Proteine, die ähnliche Peptide enthielten und anhand der MS/MS-Analyse nicht unterschieden werden konnten, wurden gruppiert, um den Grundsätzen der Sparsamkeit zu genügen. Untersucht wurden Proteine ​​mit mindestens 1 oder 2 identifizierten Peptiden und einem FDR von 1,0 oder 10,0 %.

Proteine ​​wurden mit einer Kombination aus STRING48 und Reactome49 annotiert. Metaboliten wurden in BinBase v 4.0 und KEGG verarbeitet. Vergleichsanalysen wurden in Reactome durchgeführt. Die gemeldeten Pfade hatten einen p-Wert von weniger als 10–4 (S6–S9).

Probenvorbereitungsprotokoll: 500 ml Liquor oder Serum wurden in flüssigem N2 in salzhaltigen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung eingefroren und vor dem Versand bei –80 °C gelagert. Die Proben wurden auf Trockeneis zur Probenverarbeitung und MS-Analyse an den Westcoast Metabolomics Core (Davis, CA) geschickt.

Die folgenden Methoden wurden von Feihn et al.38,50,51 übernommen. Die Proben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und 10 Sekunden lang bei niedriger Geschwindigkeit gevortext, um sie zu homogenisieren. Die Proben wurden aliquotiert (30 μl für Serum und 50 μl für CSF) und jeweils 1 ml eiskaltes 3:10 (v/v) MeOH/MTBE + QC-Gemisch/CE 22:1 (FAME-Standard) Extraktionslösungsmittelgemisch hinzugefügt Aliquotieren, wobei die Proben und das Extraktionslösungsmittel während des Verfahrens auf Eis gehalten werden. Anschließend wurde jede Probe 10 s lang verwirbelt (Mehrrohrvortexer VWR VX-2500). Alle Proben wurden dann 2 Minuten lang bei 14.000 rcf zentrifugiert. Die organischen Überstände wurden in zwei separate 450-ml-Aliquots aufgeteilt, eines für die Primäranalyse. 75 µL der verbleibenden organischen Phasen wurden in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt, um gepoolte Proben von CSF oder Serum zu erzeugen. Die verbleibenden organischen Phasen wurden abgetrennt und als Backup bei –20 °C aufbewahrt. Alle primären und gepoolten Proben wurden in Vauco mit einem Speed-Vakuum-Konzentrationssystem (Labcono Centrivap Kühlfalle) getrocknet. Serumproben wurden weiter gereinigt, indem sie in 500 μl 50:50 (v/v) ACN:H2O, entgast mit Argon, resuspendiert wurden. Die Proben wurden 2 Minuten lang bei 14.000 Ref zentrifugiert und die Überstände (475 μl) in neue Eppendorf-Röhrchen überführt.

Um sehr hydrophobe Lipide zu entfernen, wurden Serum- und CSF-Proben in 500 μl 50:50 (v/v) ACN:H2O, entgast mit Argon, resuspendiert. Die Proben wurden 2 Minuten lang bei 14.000 Ref zentrifugiert und die Überstände (475 μl) in neue Eppendorf-Röhrchen überführt.

Der Agilent 6890 GC ist mit einem automatischen Liner-Austauschsystem (ALEX) von Gerstel ausgestattet, das eine Doppelschiene für Mehrzweckproben (MPS2) und ein Kaltinjektionssystem Gerstel CIS (Gerstel, Mühlheim, Deutschland) mit folgendem Temperaturprogramm umfasst: 50 °C auf 275 °C Endtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 12 °C/s erhitzt und 3 Minuten lang gehalten. Das Injektionsvolumen beträgt 0,5 μl mit einer Injektionsgeschwindigkeit von 10 μl/s auf einem spitless-Injektor mit einer Spülzeit von 25 s. Zur Qualitätssicherung wurde der Liner (Gerstel #011,711-010-00) nach jeweils 10 Proben gewechselt (mit der Maestro1 Gerstel-Software vs. 1.1.4.18). Vor und nach jeder Injektion wird die 10 μL-Injektionsspritze dreimal mit 10 μL Ethylacetat gewaschen.

Eine 30 m lange, 0,25 mm ID Rtx-5Sil MS-Säule (0,25 μm 95 %, Dimethyl 5 %, Diphenylpolysiloxanfilm) mit zusätzlicher 10 m integrierter Schutzsäule (Restek, Bellefonte PA). 99,9999 % reines Helium mit integriertem Luftreiniger (Airgas, Radnor PA) ist auf einen konstanten Durchfluss von 1 ml/Minute eingestellt. Die Ofentemperatur wird 1 Minute lang konstant bei 50 °C gehalten und dann mit 20 °C/Minute auf 330 °C erhöht, wo sie 5 Minuten lang konstant gehalten wird. Ein Leco Pegasus IV Flugzeitmassenspektrometer wird von der Leco ChromaTOF-Software versus 2.32 (St. Joseph, MI) gesteuert. Die Temperatur der Übertragungsleitung zwischen Gaschromatograph und Massenspektrometer ist auf 280 °C eingestellt. Die Elektronenstoßionisation bei 70 V wird bei einer Ionenquellentemperatur von 250 °C eingesetzt. Die Aufnahmerate beträgt 17 Spektren/Sekunde, mit einem Scan-Massenbereich von 85–500 Da.

Rohdatendateien werden direkt nach der Datenerfassung vorverarbeitet und als ChromaTOF-spezifische *.peg-Dateien, als generische *.txt-Ergebnisdateien und zusätzlich als generische ANDI MS *.cdf-Dateien gespeichert. Die Vorverarbeitung in ChromaTOF vs. 2.32 (Leco) wird ohne Glättung durchgeführt, eine Basisliniensubtraktion wird zusammen mit automatischer spektraler Entfaltung und Peakerkennung mit einem S/N von 5:1 durchgeführt. Apex-Massen und eine entsprechende *.txt-Ausgabe mit den absoluten Eingeweiden werden zur weiteren Verarbeitung durch einen Filteralgorithmus exportiert, der in der Metabolomics-Datenbank BinBase v 4.0 implementiert ist. Details zum BinBase-Algorithmus (https://code.google.com/p/binbase/) wurden von Feihn et al.27,38 entwickelt. Spektren werden in BinBase automatisch an den QC-Mix angepasst und Proben wurden auf die Summenpeakhöhen normalisiert aller strukturell identifizierten Verbindungen – zur Korrektur der Matrixeffekte von Serum und CSF. Bekannte Metaboliten werden ihrem jeweiligen PubChem-, KEGG- und InChi-Schlüssel zugeordnet.

Für alle in mindestens einer der Proben nachgewiesenen Proteine ​​wurden fehlende Intensitätswerte unterstellt. Wir gingen davon aus, dass die Intensitäten einer logarithmischen Normalverteilung folgten, wobei die Nachweisschwelle zwischen Proteinen und Matrizen variierte. Wir haben jede abgeschnittene Verteilung angepasst, um den Mittelwert und die Varianz zu ermitteln, wobei wir den Schwellenwert als gleich der kleinsten der beobachteten Intensitäten angenähert haben. Wenn für ein Protein weniger als drei Intensitätswerte beobachtet wurden, haben wir einen Mittelwert und eine Standardabweichung angenommen, die dem Durchschnitt über die angepassten Verteilungen entsprechen (Mittelwert = 4, Standard = 1). Nicht beobachtete Werte wurden durch die Generierung von Zufallszahlen aus dem zensierten Teil der abgeleiteten Verteilungen unterstellt. Für Metabolomics-Daten berechnete BinBase Intensitätswerte, wenn in mindestens einer der Proben ein Metabolit nachgewiesen wurde38. Die unterstellten Werte wurden so gewählt, dass die Intensität in jedem Massenspektrum im Bereich des unerklärlichen Rauschens lag.

Alle Analysen wurden nach Imputation fehlender Werte mit R 3.6.3 durchgeführt. Um zu beurteilen, ob sich die Intensitäten hinsichtlich des Probentyps (CSF vs. Serum) unterschieden, führten wir zunächst eine Hauptkomponentenanalyse für jeden der Proteomik- und Metabolomik-Datensätze durch. Anschließend haben wir die Stichproben auf den ersten beiden Hauptkomponenten aufgetragen, um Unterschiede in diesem vereinfachten Raum zu beobachten. Wir identifizierten einzelne Proteine, die sich in der relativen Intensität zwischen den Probentypen signifikant unterschieden, indem wir gepaarte Proben-t-Tests am Logarithmus der Konzentrationen durchführten und die p-Werte für die Testvielfalt mithilfe der Benjamini-Hochberg-Methode anpassten. Wir haben außerdem die durchschnittliche fache Änderung der Intensität zwischen den Teilnehmern berechnet, um die klinische Bedeutung der Ergebnisse zu beurteilen.

Wir untersuchten, ob Teilnehmergruppen offenbar ähnliche Proteomikprofile aufwiesen. Zu diesem Zweck haben wir für jeden der beiden Probentypen eine Hauptkomponentenanalyse durchgeführt. Anschließend wählten wir Komponenten aus, bei denen die erklärte Varianz scheinbar ein Signal-zu-Rauschen-Verhältnis war (vor dem Ellenbogen der Darstellung der erklärten Varianz gegenüber der Komponentenanzahl). Unter Verwendung dieser Komponenten führten wir eine hierarchische Clusterbildung mit der Ward-Distanz durch und zeichneten den erhaltenen Baum auf. Anschließend beurteilten wir visuell, ob es scheinbar Gruppen mit ähnlichen Profilen gab. Anschließend wurden die Teilnehmergruppen je nach Alter und Geschlecht mithilfe von T-Tests bzw. Chi-Quadrat-Tests verglichen. Das oben Gesagte wurde für Metabolomics-Daten wiederholt.

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Wir möchten dem DOD R-00674-19-0, Laurie Samitaur Smith und der Familie Samitaur für die finanzielle Unterstützung danken. Die ersten Arbeiten, die zu diesem Vorhaben führten, wurden durch ein kooperatives Forschungs- und Entwicklungsprojekt zwischen LANL und Samitaur Medical Technologies finanziert, und wir sind dem Team für die Unterstützung dieses Vorhabens dankbar. Wir möchten dem UC Davis Genome Center Proteomics Center für die Datengenerierung und Datenverarbeitung danken (LC-MS wurde von NIH S10OD021801 unterstützt). Wir möchten dem UC Davis West Coast Metabolomics Center für die Datengenerierung und Datenverarbeitung danken (NIH U2C ES030158).

Los Alamos National Laboratory, PO Box 1663, Los Alamos, NM, 87545, USA

Laura M. Lilley, Steven Sanche, Shepard C. Moore, Dung Vu, Srinivas Iyer, Nicolas W. Hengartner und Harshini Mukundan

Genome Center, Proteomics Core Facility, University of California, Davis, CA, 95616, USA

Michelle R. Salemi

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LL war für einen erheblichen Teil der experimentellen Durchführung, Datenanalyse, Erstellung von Zahlen und Manuskripterstellung verantwortlich. SS und NH trugen zur Datenanalyse und Statistik sowie zum Verfassen von Manuskripten bei. SM trug zu Laborexperimenten bei. MRS und SI waren für die massenspektrometrischen Arbeiten verantwortlich. DV entwickelte Originalprotokolle und war Mitentwickler des Studiendesigns. HM konzipierte die Studie und sicherte als PI die Finanzierung, entwickelte das Studiendesign, die Leitung und Durchführung sowie das Verfassen und Bearbeiten des Manuskripts. SI, DV und NH trugen ebenfalls zum Studiendesign und der Studienentwicklung bei.

Korrespondenz mit Harshini Mukundan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Lilley, LM, Sanche, S., Moore, SC et al. Methoden zur Erfassung proteomischer und metabolomischer Signaturen aus Liquor und Serum gesunder Personen. Sci Rep 12, 13339 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16598-1

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Eingegangen: 01. Februar 2022

Angenommen: 17. Mai 2022

Veröffentlicht: 03. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16598-1

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