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Dec 16, 2023

Der Akt

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 15881 (2015) Diesen Artikel zitieren 3194 Zugriffe 34 Zitate Metrikdetails Das Herz weist zwei Hauptmodalitäten der Hypertrophie als Reaktion auf die Hämodynamik auf

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 15881 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Das Herz weist zwei Hauptmodalitäten der Hypertrophie als Reaktion auf hämodynamische Belastungen auf: konzentrische und exzentrische Hypertrophie, die durch Druck bzw. Volumenüberlastung (VO) verursacht werden. Der molekulare Mechanismus der exzentrischen Hypertrophie ist jedoch noch immer kaum verstanden. Hier zeigen wir, dass die Akt-Säugetier-Zielachse von Rapamycin (mTOR) ein zentraler Regulator der exzentrischen Hypertrophie während VO ist. Während mTOR im Herzen abhängig vom linksventrikulären enddiastolischen Druck (LVEDP) aktiviert wurde, unterdrückte die mTOR-Hemmung die exzentrische Hypertrophie und induzierte selbst unter VO eine Herzatrophie. Bemerkenswert ist, dass Akt als Reaktion auf VO ubiquitiniert und phosphoryliert wurde und die Blockierung der Rekrutierung von Akt an der Membran die mTOR-Aktivierung vollständig aufhob. Während der VO wurden verschiedene Wachstumsfaktoren hochreguliert, was darauf hindeutet, dass diese möglicherweise an der Akt-mTOR-Aktivierung beteiligt sind. Darüber hinaus war die Geschwindigkeit des Fortschreitens der exzentrischen Hypertrophie proportional zur mTOR-Aktivität, was eine genaue Schätzung der exzentrischen Hypertrophie durch Zeitintegration der mTOR-Aktivität ermöglichte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Akt-mTOR-Achse eine zentrale Rolle bei der exzentrischen Hypertrophie spielt und die mTOR-Aktivität quantitativ die Geschwindigkeit des Fortschreitens der exzentrischen Hypertrophie bestimmt. Da die exzentrische Hypertrophie ein inhärentes System des Herzens zur Regulierung des Herzzeitvolumens und des LVEDP ist, liefern unsere Ergebnisse neue mechanistische Einblicke in den Anpassungsmechanismus des Herzens.

Das Herz ist ein lebenswichtiges Organ, das über die Blutzirkulation die Homöostase im Körper aufrechterhält. Um die Blutzirkulation im peripheren Gewebe aufrechtzuerhalten, ist das Herz in der Lage, sich als Reaktion auf verschiedene Belastungen, darunter hämodynamische Belastung, Neurohormone, oxidativer Stress und Zytokine, umzugestalten1,2,3. Dabei stellen mechanische Belastungen eine wesentliche Belastung für das Herz dar, da das Herz ständig hämodynamischen Belastungen ausgesetzt ist. Da mechanische Belastung eine Hypertrophie induziert, können mechanische Dehnungskräfte in Systole und Diastole in Myozyten in vivo gemäß dem Laplaceschen Gesetz als Wandspannungen in Systole und Diastole berechnet werden. Im Jahr 1975 stellten Grossman et al. zeigten, dass eine Drucküberlastung (PO) die systolische Wandspannung erhöht, was zu einer konzentrischen Hypertrophie führt, die wiederum die systolische Wandspannung normalisiert, und dass eine Volumenüberlastung (VO) die diastolische Wandspannung erhöht, was zu einer exzentrischen Hypertrophie führt1. Basierend auf dieser klinischen Beobachtung schlugen sie vor, dass die hypertrophe Reaktion durch eine erhöhte Wandspannung hervorgerufen wurde1. Derzeit ist es allgemein anerkannt, dass erhöhte systolische und diastolische Wandspannungen zu konzentrischer bzw. exzentrischer Hypertrophie führen4. Viele Hinweise deuten darauf hin, dass sich konzentrische und exzentrische Hypertrophie nicht nur hinsichtlich des Phänotyps, sondern auch hinsichtlich der beteiligten intrazellulären Signalwege unterscheiden5,6. Verschiedene Studien untersuchten den molekularen Mechanismus der Hypertrophie, insbesondere der durch PO7,8 verursachten konzentrischen Hypertrophie; Der molekulare Mechanismus der exzentrischen Hypertrophie muss jedoch noch vollständig aufgeklärt werden.

Mitral- und Aorteninsuffizienz sind typische Pathophysiologien, die VO verursachen, insbesondere in der akuten Phase9. Bei diesen Pathophysiologien führt eine unzureichende Nettovorwärtsleistung unweigerlich zu einer Lungenstauung, die aus einem erhöhten linksventrikulären enddiastolischen Druck (LVEDP) und einer diastolischen Wandbelastung des linken Ventrikels (LV) resultiert. Die exzentrische Hypertrophie erhöht die Herzleistung und ermöglicht die Aufrechterhaltung der Netto-Vorwärtsleistung bei vorhandener Regurgitation, wodurch der LVEDP gesenkt und eine Lungenstauung behoben wird9. Daher scheint es, dass diastolischer Wandstress, wie durch LVEDP und LV-Geometrie definiert, eine exzentrische Hypertrophie als physiologisch gut konzipiertes Rückkopplungssystem zur Regulierung von LVEDP auslöst.

Darüber hinaus ist das Herz bei Herzinsuffizienz (HF) unabhängig von der Ätiologie einer übermäßigen diastolischen Wandbelastung ausgesetzt, da es sich bei der Herzinsuffizienz um ein Syndrom handelt, das durch niedriges Herzzeitvolumen und Lungenstauung (aufgrund eines hohen LVEDP) gekennzeichnet ist. Daher ist das Verständnis des noch zu klärenden molekularen Mechanismus der exzentrischen Hypertrophie während VO wichtig, um die Pathophysiologie von HF vollständig zu verstehen.

Grant et al. und Grossman et al. schlugen vor, dass die exzentrische Hypertrophie aus physiologischer Sicht analog zum normalen Herzwachstum ist, da beide Prozesse die Herzleistung erhöhen, was darauf hindeutet, dass die strukturellen Veränderungen der exzentrischen Hypertrophie und des Herzwachstums einen gemeinsamen Mechanismus haben1,10. Der Signalweg Phosphoinositid-3-Kinase/Proteinkinase B/Säugetierziel von Rapamycin (PI3K/Akt/mTOR) spielt eine wichtige Rolle beim Zell- und Organwachstum11. mTOR wurde in den frühen 1990er Jahren identifiziert12,13 und ist das Kernprotein zweier funktionell unterschiedlicher Komplexe, die als mTOR-Komplex 1 (mTORC1) und mTOR-Komplex 2 (mTORC2)11,14 bezeichnet werden. mTORC1 wird durch verschiedene Signale aktiviert, darunter Insulin, Wachstumsfaktoren, Kalzium und Aminosäuren, über Rezeptoren wie den Rezeptor für Tyrosinkinasen und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren15,16. mTORC1 fungiert als Serin/Threonin-Kinase und phosphoryliert p70S6K bei Thr389 und 4E-BP bei Thr37/46 und Ulk-1 bei Ser757, wodurch die Proteinsynthese bzw. die Makroautophagie reguliert wird17,18. mTORC1 reguliert das Zellwachstum durch Proteinsynthese und es wurde berichtet, dass mTOR- und Hippo-Signalwege zusammenarbeiten, um die Organgröße zu bestimmen19,20. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die exzentrische Hypertrophie durch die mTORC1-Aktivierung als Reaktion auf diastolischen Wandstress reguliert wird.

Auf dem Gebiet der Kardiologie beschrieben Sadoshima und Izumo erstmals die Rolle von mTOR bei der Angiotensin-II-induzierten Hypertrophie in Myozyten21. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass mTOR an der PO-induzierten Hypertrophie und dem LV-Remodelling nach einem Myokardinfarkt bei Mäusen beteiligt ist22,23. Während diese Studien darauf hinwiesen, dass mTOR eine Schlüsselrolle in der Physiologie und Pathologie des Herzens spielt24, ist der genaue Mechanismus der mTOR-Regulation im Herzen noch unbekannt.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Akt-mTOR-Achse die exzentrische Hypertrophie während VO als Reaktion auf diastolischen Wandstress reguliert und dass die mTOR-Aktivität die Geschwindigkeit des Fortschreitens der exzentrischen Hypertrophie bestimmt, indem wir gezeigt haben, dass das Herzgewicht (HW) während VO genau sein kann geschätzt durch Zeitintegration der mTOR-Aktivität.

Wir haben zunächst ein exzentrisches Hypertrophiemodell etabliert, das mit einer Zunahme der Herz- und LV-Masse sowie einer LV-Dilatation einhergeht, indem wir eine arteriovenöse Fistel (AVF) in der Bauchaorta erzeugt haben, ohne dass eine Veränderung der mittleren Wanddicke erkennbar war (Abb. 1a–e). In diesem Modell nahm die Herzhypertrophie bis zum 28. Tag stetig zu, mit einem leichten, aber signifikanten Anstieg des linksventrikulären Durchmessers in der Systole (LVDs) und einer Beeinträchtigung der linksventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF) (Abb. 1f, g). Der LVEDP und der diastolische Wandstress erreichten am 7. Tag einen Höhepunkt, nahmen danach ab und kehrten am 28. Tag auf die Ausgangswerte zurück (Abb. 1h, i). Der anfängliche Anstieg des LVEDP bis zum 7. Tag kann durch eine kompensatorische Volumenretention zur Aufrechterhaltung des systemischen Drucks, insbesondere in den Nieren, verursacht werden, während die Normalisierung des LVEDP und des diastolischen Wandstresses nach dem 7. Tag mit dem zeitlichen Verlauf der verursachten chronischen VO übereinstimmte durch Mitral- oder Aorteninsuffizienz beim Menschen9. Es ist anzumerken, dass VO weder die Herzfrequenz noch den Spitzendruck veränderte (ergänzende Abbildung S1a, b), was darauf hinweist, dass der hämodynamische Stress in diesem VO-Modell ausschließlich auf den diastolischen Wandstress zurückzuführen ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die exzentrische Hypertrophie, die aus der diastolischen Wandbelastung während der VO resultiert, ein physiologisches Rückkopplungssystem zur Regulierung des LVEDP ist, das eine übermäßige Vorlast durch LV-Dilatation abfedert.

Herzhypertrophie, Funktion und Hämodynamik während VO nach AVF-Erstellung.

(a) Echokardiogramm von VO nach AVF-Erstellung. (b–i) Herzgewicht (HW) (b), linksventrikuläres (LV) Gewicht des linken Ventrikels (LV) (c), linksventrikulärer Durchmesser in der Diastole (LVDd) (d), mittlere Wandstärke (Durchschnitt des interventrikulären Septums). und der linksventrikulären Hinterwand) (e), linksventrikulärer Durchmesser in der Systole (LVDs) (f), linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) (g), linksventrikulärer enddiastolischer Druck (LVEDP) (h), diastolische Wandspannung ( i) während des 4-wöchigen Zeitkurses von VO. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 4) angezeigt. *P < 0,05, **P < 0,01 gegenüber Tag 0 (Dunnett-Test).

Bei der exzentrischen Hypertrophie handelt es sich um strukturelle Veränderungen des Herzens, die die Herzleistung erhöhen und physiologisch denen ähneln, die während des Herzwachstums auftreten, wobei der PI3K/Akt/mTOR-Signalweg eine wichtige Rolle spielt. Daher wurde die Rolle von mTORC1 bei der Vermittlung exzentrischer Hypertrophie untersucht, indem der Phosphorylierungsstatus von S6 und 4E-BP beurteilt wurde. Die erhöhte Phosphorylierung der beiden Proteine ​​​​wies darauf hin, dass die mTOR-Aktivität während der VO in Abhängigkeit vom diastolischen Wandstress zunahm (Abb. 2a). Die Beziehung zwischen diastolischem Wandstress und dem Verhältnis von phosphoryliertem S6/S6 folgte einer sigmoidalen Kurve (R2 = 0,90) (Abb. 2b). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass der verlängerte Reiz die Signalübertragung bei der durch mechanische Dehnung induzierten mTOR-Aktivierung während der Spätphase veränderte, wurde die mTOR-Aktivität im Myokard 24 Stunden nach der AVF-Erzeugung bewertet. Das Herz wurde innerhalb von 24 Stunden unterschiedlichen diastolischen Belastungen ausgesetzt, indem die Größe des Shunts mithilfe von Eindringnadeln unterschiedlicher Größe verändert wurde. Wie erwartet hing die LVEDP-Erhöhung von der Shuntgröße ab (Abb. 2c), und die S6- und 4E-BP-Phosphorylierung, dh die mTOR-Aktivierung, korrelierte mit dem LVEDP (Abb. 2d). Das Verhältnis von phosphoryliertem S6/S6 korrelierte gut quadratisch mit LVEDP (R2 = 0,92) (Abb. 2e). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der diastolische Wandstress die mTOR-Aktivität steuert.

Zusammenhang zwischen LVEDP und mTOR-Aktivität.

(a) Western Blot von Zelllysaten, die während 4 Wochen VO aus Herzgewebe gewonnen wurden und auf Gesamt- und phosphoryliertes S6 und 4E-BP untersucht wurden. (b) Zusammenhang zwischen diastolischem Wandstress und mTOR-Aktivität während 4 Wochen VO. (c) Linksventrikulärer enddiastolischer Druck (LVEDP) 24 Stunden nach der Induktion von VO unter Verwendung verschiedener Nadelgrößen zum Eindringen in die Vene/Arterie (n = 3). (d) Western-Blot von Zelllysaten, die 24 Stunden nach der VO-Induktion aus Herzgewebe gewonnen wurden, unter Verwendung verschiedener Nadelgrößen zum Eindringen in die Arterie, untersucht auf Gesamt- und phosphoryliertes S6 und 4E-BP. (e) Zusammenhang zwischen LVEDP und S6-Phosphorylierungsrate 24 Stunden nach der VO-Induktion. GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. **P < 0,01 vs. Scheintest (Dunnett-Test).

Um die Rolle von mTOR bei der exzentrischen Hypertrophie zu klären, untersuchten wir die Auswirkungen von Temsirolimus, einem allosterischen Inhibitor von mTOR und einem Rapamycin-Derivat, auf die exzentrische Hypertrophie. Die mTOR-Hemmung unterdrückte nicht nur die exzentrische Hypertrophie, sondern induzierte auch eine Herzatrophie, die durch eine Abnahme des LV-Durchmessers in der Diastole (LVDd) und HW sowie durch S6- und 4E-BP-Dephosphorylierung gekennzeichnet war (Abb. 3a – c). Interessanterweise war die Überlebensrate unter VO in der mit Temsirolimus behandelten Gruppe signifikant niedriger als in der mit Vehikel behandelten Gruppe, während LVDs und LVEF in allen Gruppen erhalten blieben (Abb. 3d, ergänzende Abb. S2). Diese Ergebnisse legen nahe, dass mTOR ein entscheidender Regulator der exzentrischen Hypertrophie während einer VO ist und dass die exzentrische Hypertrophie für das Überleben bei akuter VO von entscheidender Bedeutung ist.

Wirkung der mTOR-Hemmung auf die exzentrische Hypertrophie während VO.

(a) Echokardiogramm von AVF- oder scheinoperierten Mäusen, die am Tag 3 nach der AVF-Erzeugung mit Temsirolimus (Tem) oder Vehikel (Veh) behandelt wurden. (b) LVDd (linkes Feld) und HW/Tibialänge (rechtes Feld) am 3. Tag der VO (n = 3–4). (c) Western-Blot von Zelllysaten, die aus Herzgewebe von AVF- oder scheinoperierten Mäusen gewonnen wurden, die am 3. Tag der VO mit Tem oder Veh behandelt wurden, untersucht auf Gesamt- und phosphoryliertes S6 und 4E-BP. GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet. (d) Überlebensanalyse von AVF- oder scheinoperierten Mäusen, die über 7 Tage VO mit Tem oder Veh behandelt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. *P < 0,05, **P < 0,01 vs. Schein, #P < 0,05, ##P < 0,01 vs. VO + Veh (einfaktorielle ANOVA). Die Überlebensanalyse wurde nach der Kaplan-Meier-Methode durchgeführt und die Überlebensunterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Log-Rank-Test bewertet.

Darüber hinaus wurde auch die atrophische Wirkung der mTOR-Hemmung auf die etablierte exzentrische Hypertrophie untersucht. Wegen AVF operierte Mäuse wurden 4 Wochen nach der AVF-Erzeugung randomisiert in mit Temsirolimus und Vehikel behandelte Gruppen eingeteilt und erhielten 1 Woche lang Temsirolimus oder Vehikel (ergänzende Abbildung S3a). Die mTOR-Hemmung reduzierte LVDd und HW, was darauf hindeutet, dass sie eine Herzatrophie bei der etablierten exzentrischen Hypertrophie induzierte (ergänzende Abbildung S3b – c).

Akt ist die bekannteste Kinase, die die mTOR-Aktivierung vermittelt, und wird während VO6 phosphoryliert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Phosphorylierung von Akt an Ser473 und von PRAS als Reaktion auf diastolischen Wandstress während der VO konsistent war (Abb. 4a). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung der Akt- und Akt-Downstream-Signalisierung (PRAS und S6) 1–3 Stunden nach der AVF-Erzeugung erfolgt (Abb. 4b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Akt an der mTOR-Aktivierung unter VO beteiligt ist.

Phosphorylierung und Ubiquitinierung von Akt als Reaktion auf VO.

(a) Western-Blot von Zelllysaten, die während 4 Wochen VO aus Herzgewebe gewonnen wurden und auf Gesamt- und phosphoryliertes Akt und PRAS untersucht wurden. (b) Western Blot von Zelllysaten, die während 3 Stunden VO aus dem Herzgewebe gewonnen wurden und auf die angegebenen Komponenten des Akt-mTOR-Signalwegs untersucht wurden. (c) Gesamt- und phosphorylierte Akt-Expression im Herzgewebe nach 2 Stunden VO (mit langer Belichtungszeit). Das Verschmieren der Proteinbande lässt auf eine posttranslationale Modifikation der Akt-Reste schließen. (d) Immunoblot (IB) von K63-Ubiquitin in Immunpräzipitaten (IP) von Herzgewebelysaten, nachgewiesen mit einem Antikörper gegen Akt. GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet.

Die Immunoblot-Analyse ergab außerdem einen leichten Rückgang des gesamten Akt-Spiegels unter VO (Abb. 4b), was darauf hindeutet, dass Akt unter diesen Bedingungen möglicherweise einer posttranslationalen Modifikation unterliegt. Bei längerer Exposition der Membran wurde ein Verschmieren der Akt-Bande in den diastolisch belasteten Herzproben sowohl für Gesamt- als auch für phosphoryliertes Akt beobachtet, was auf eine posttranslationale Modifikation der Akt-Reste hinweist (Abb. 4c).

Zusätzlich zur Phosphorylierung umfasst die posttranslationale Modifikation von Akt bekanntermaßen auch O-GlcNAcylierung und Ubiquitinierung25,26,27. Für die Membranrekrutierung und die anschließende Phosphorylierung von Akt ist eine K63-verknüpfte Ubiquitinierung erforderlich. Daher untersuchten wir die K63-Ubiquitinierung von Akt während VO und stellten fest, dass Akt durch K63-Ubiquitinierung unter VO modifiziert wurde (Abb. 4d). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass sowohl die K63-Ubiquitinierung als auch die Phosphorylierung von Akt eine Schlüsselrolle bei der mTOR-Aktivierung während VO spielen könnten.

Um zu beurteilen, ob Akt diastolischen Wandstress über mTOR-Aktivierung vermittelt, verwendeten wir den allosterischen Inhibitor MK-2206, der auf die Pleckstrin-Homologiedomäne (PH) abzielt und die Rekrutierung von Akt an der Zellmembran verhindert28,29. MK-2206 hat nachweislich eine hohe Spezifität für Akt und eine viel geringere Wirkung auf mTOR und p70S6 K30. Die Akt-Phosphorylierung wurde erstmals 10 Minuten nach der AVF-Erstellung beobachtet (ergänzende Abbildung S4a) und hielt bis 3 Stunden nach der AVF-Erstellung an (Abb. 4b). Bei Mäusen, denen MK-2206 (120 mg/kg) oral verabreicht wurde, wurde die Akt- und S6-Phosphorylierung 4–16 Stunden bzw. 8–20 Stunden nach der Verabreichung gehemmt (ergänzende Abbildung S4b). Daher wurde der AVF 6 Stunden nach der Verabreichung von MK-2206 erstellt und Myokardproben wurden 2 Stunden später nach der AVF-Erstellung entnommen. Die Phosphorylierung von sowohl ubiquitiniertem als auch nicht ubiquitiniertem Akt wurde durch die Behandlung mit MK-2206 gehemmt und die S6-Phosphorylierung wurde gleichzeitig unterdrückt, was darauf hindeutet, dass Ubiquitinierung, Membranrekrutierung und Phosphorylierung von Akt für die Aktivierung von mTOR unter VO erforderlich sind (Abb. 5a). Darüber hinaus wurde die mTOR-Aktivierung am 3. Tag von VO durch MK-2206 vollständig gehemmt (Abb. 5b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Akt ein Schlüsselmediator der durch mechanische Belastung induzierten mTOR-Aktivierung während VO ist.

Rolle von Akt bei der mTOR-Aktivierung während VO.

(a) Western Blot von Zelllysaten, die aus Herzgewebe nach 2 Stunden VO nach 6 Stunden MK-2206-Vorbehandlung gewonnen wurden, untersucht auf Gesamt- und phosphoryliertes Akt und S6 (mit langer Membranexpositionszeit). (b) Western-Blot-Analyse von gesamtem und phosphoryliertem Akt und S6 8 Stunden nach der Verabreichung von MK-2206 am Tag 3 von VO. (c) Western-Blot von Zelllysaten, die am 3. Tag von VO aus dem rechten Ventrikel (RV) und dem rechten und linken Vorhof (RA bzw. LA) gewonnen und auf Gesamt- und phosphoryliertes Akt und S6 untersucht wurden. GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet.

Im in dieser Studie verwendeten VO-Modell induzierte AVF VO nicht nur im linken Ventrikel, sondern auch im rechten und linken Vorhof sowie im rechten Ventrikel. Daher untersuchten wir die Akt-mTOR-Signalübertragung in diesen Kammern und stellten fest, dass die Akt-mTOR-Signalübertragung während der VO aktiviert und durch MK-2206 vollständig blockiert wurde, was darauf hinweist, dass die Rolle der Akt-mTOR-Signalübertragung bei der exzentrischen Hypertrophie während der VO in allen Kammern von gleich ist das Herz (Abb. 5c).

Zur Identifizierung von Akt-Aktivatoren wird die Expression verschiedener Wachstumsfaktoren untersucht, darunter der insulinähnliche Wachstumsfaktor (IGF)-1 und -2, Neuregulin (NRG)-1, der Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF) und der aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktor (PDGF). -A, -B, -C und -D wurden untersucht. Die Expression von NRG-1, IGF-2 und CTGF war am Tag 1 nach der AVF-Erzeugung hochreguliert, die von IGF-1, IGF-2, NRG-1, CTGF und PDGF-C war am Tag 7 signifikant hochreguliert und die von CTGF , PDGF-B und PDGF-D am Tag 14 (Abb. 6). Diese Ergebnisse legen die Möglichkeit nahe, dass mehrere Wachstumsfaktoren an der Akt-mTOR-Aktivierung während der VO beteiligt sind.

Genexpression verschiedener Wachstumsfaktoren während VO.

Die IGF-, NRG-, CTGF- und PDGF-Expression wurde durch RT-qPCR quantifiziert und auf die Expression des 18S-rRNA-Gens normalisiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 4) angezeigt. *P < 0,05, **P < 0,01 gegenüber Tag 0 (Dunnett-Test).

mTOR ist als geschwindigkeitsbestimmende Kinase für das Zell- und Organwachstum bekannt19,20. Wir haben den HW-Trend während der VO mit der Excel-Software an die Kurve angepasst (ergänzende Abbildung S5a) und 28 Punkte aus der angepassten Kurve mit Graphcel v1.11 erneut abgetastet (ergänzende Abbildung S5b). Als nächstes berechneten wir die Differenz zwischen aufeinanderfolgenden erneut abgetasteten Punkten (ergänzende Abbildung S5c), die der Rate des Fortschreitens der exzentrischen Hypertrophie pro Tag entsprach. Diese detaillierte Analyse ergab, dass der Trend der Progressionsrate während der VO dem jedes Durchschnittswerts (n = 2) der mTOR-Aktivität ähnelt (ergänzende Abbildung S5d), was darauf hindeutet, dass die mTOR-Aktivität linear die Rate des Fortschreitens der exzentrischen Hypertrophie bestimmt. Daher haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die Anstiegsrate des HW (v mg/Zeiteinheit) während der VO proportional zur mTOR-Aktivität ist, da v = α × mTOR-Aktivität (wobei α eine geeignete Konstante ist). Somit ergibt die Zeitintegration von v HW wie folgt:

Dabei ist HW(0) das anfängliche HW (=110) und mTOR (t) die zeitlich variierende mTOR-Aktivität.

Wir haben die Punkte in jedem Durchschnitt der mTOR-Aktivität (n = 2) während VO in einem Diagramm dargestellt und jeden Punkt verbunden, wie in der ergänzenden Abbildung S5d gezeigt, und 100 Datenpunkte pro Tag wurden erneut abgetastet. Die erneut abgetasteten Daten gaben die experimentell gemessene mTOR-Aktivität genau wieder (Abb. 7a). Wir haben Gleichung (1) mit dem Simulink-Programm gelöst (Abb. 7b). Die geschätzte HW-Kurve kam der experimentell gemessenen HW-Kurve gut nahe (Abb. 1b und Abb. 7c). Darüber hinaus stimmten die absoluten Werte der geschätzten HW gut mit den gemessenen überein, wenn die entsprechende Konstante (α = 0,001) angegeben wurde (Abb. 7d). Diese Ergebnisse lieferten starke Beweise dafür, dass die mTOR-Aktivität proportional zur Geschwindigkeit des Fortschreitens der exzentrischen Hypertrophie während der VO ist.

Schätzung des Fortschreitens der exzentrischen Hypertrophie während der VO.

(a) Reproduzierte Kurve der mTOR-Aktivität während VO aus neu abgetasteten Datenpunkten. (b) Schematisches Diagramm zur Schätzung von HW aus der Zeitreihe der mTOR-Aktivität (pS6/S6-Verhältnis) während VO. (c) Geschätzte HW während VO, wenn α = 0,001. (d) Korrelation zwischen gemessener und geschätzter HW. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 4) angezeigt.

Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die mathematische Beziehung zwischen diastolischem Wandstress (σ) und mTOR-Aktivität wie folgt war (Abb. 2b):

Das Einsetzen der mTOR-Aktivität in Gleichung (2) in (1) und σ durch d × p/4h ergab eHW wie folgt:

(Abbildung 8a). Gleichung 3 zeigt, dass das Fortschreiten der exzentrischen Hypertrophie während der VO genau geschätzt werden kann, sobald die physiologischen Parameter d (LVDd) und p (LVEDP) für die Schätzung der diastolischen Wandspannung bestimmt sind. Tatsächlich reproduzierten Datensätze, die auf 100 neu abgetasteten Datenpunkten pro Tag von LVEDP und LVDd basierten, die experimentell gemessenen LVEDP und LVDd (Abb. 8b) und ermöglichten eine genaue Schätzung der mTOR-Aktivität durch Gleichung (2), wenn die mittlere Wanddicke (h) betrug angenähert durch seinen Durchschnittswert am Tag 0 (= 0,70) (Abb. 8c), da er sich während der VO nicht signifikant veränderte (Abb. 1e). Darüber hinaus haben wir die HW während VO anhand von Gleichung (3) genau geschätzt (Abb. 8d), was ergab, dass eHW eng mit der gemessenen HW korreliert, wenn α = 0, 001 (Abb. 8e). Diese Ergebnisse legen nahe, dass wir das Fortschreiten der exzentrischen Hypertrophie bei Mäusen anhand physiologischer Parameter wie LVEDP und LVDd abschätzen können.

Schätzung der exzentrischen Hypertrophie während VO anhand der physiologischen Parameter LVEDP und LVDd.

(a) Schematisches Diagramm zur Schätzung von HW aus LVEDP und LVDd. (b) LVEDP- (linkes Feld) und LVDd-Kurven (rechtes Feld) wurden mit Simulink aus neu abgetasteten Datenpunkten reproduziert. (c) Geschätzte mTOR-Aktivität während VO. (d) Geschätzte HW während VO, wenn α = 0,001. (e) Korrelation zwischen gemessener und geschätzter HW. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 4) angezeigt.

Aus der Analyse des VO-Modells sowohl auf physiologischer als auch auf molekularer Ebene gingen drei wichtige Erkenntnisse hervor: 1) mTOR, dessen Aktivität von der diastolischen Wandspannung abhängt, ist ein zentraler Regulator der exzentrischen Hypertrophie während VO; 2) Akt ist ein wichtiger Mediator der mTOR-Aktivierung bei mechanischer Dehnung in der Diastole; und 3) die Geschwindigkeit des Fortschreitens der exzentrischen Hypertrophie während der VO ist proportional zur mTOR-Aktivität, was eine genaue Schätzung des Fortschreitens der exzentrischen Hypertrophie basierend auf LVDd- und LVEDP-Datensätzen ermöglicht.

Nach unserem besten Wissen ist dies der erste Bericht über die genaue Identifizierung der quantitativen Beziehung zwischen LVEDP als hämodynamischer Belastung und mTOR-Aktivität während VO im Herzen und der Rolle von mTOR bei exzentrischer Hypertrophie. Einige frühere Studien konzentrierten sich auf die Rolle von mTOR im PO-Modell und zeigten, dass mTOR in diesem Modell im Herzen aktiviert wurde22. Derzeit gibt es jedoch keine Hinweise darauf, dass die mTOR-Aktivität mit dem systolischen Druck oder der systolischen Wandspannung korreliert, obwohl die mTOR-Aktivität in der akuten Phase eines Modells der transversalen Aortenverengung (TAC) vorübergehend erhöht war22. Eine Aortenverengung in vivo erhöht nicht nur den systolischen Druck, sondern auch den LVEDP, da ein akuter Anstieg der Nachlast im Aortenverengungsmodell zwangsläufig die Herzleistung verringert und den LVEDP erhöht31. Darüber hinaus besteht kein Zweifel daran, dass mTOR in der chronischen Phase des PO-Modells aktiviert wird, da LVEDP bei dekompensiertem HF32 im Allgemeinen ansteigt. Diese Interpretationen könnten Aufschluss darüber geben, warum mTOR auch im PO-Modell aktiviert ist. Mithilfe eines VO-Modells, bei dem kein Anstieg des systolischen Drucks beobachtet wurde, haben wir gezeigt, dass die mTOR-Aktivität eng mit der diastolischen Wandbelastung korreliert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die mTOR-Aktivität direkt durch LVEDP reguliert wird und eine Schlüsselrolle bei der durch VO verursachten exzentrischen Hypertrophie spielt.

Wir haben gezeigt, dass die mTOR-Hemmung bei Mäusen, die während der VO mit Temsirolimus behandelt wurden, im Vergleich zu scheinoperierten Mäusen, die mit Temsirolimus behandelt wurden, eine Herzatrophie induziert und die exzentrische Hypertrophie vollständig aufhebt. Wichtig ist, dass die mTOR-Hemmung eine Herzatrophie induzierte, ohne dass atrophische Gene wie Atrogin-1 und Muskel-RING-Finger-Protein (MuRF)-1, die als Ubiquitin-Ligasen fungieren, hochreguliert wurden (ergänzende Abbildung S6). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Masse oder Größe des Herzens durch das Gleichgewicht zwischen Proteinsynthese und -abbau bestimmt wurde und dass eine Herzatrophie auftrat, wenn das Gleichgewicht auf den Proteinabbau unter mTOR-Hemmung ausgerichtet war, auch ohne Hochregulierung atrophischer Gene, während bei Protein eine exzentrische Hypertrophie auftrat Synthese unter VO dominiert.

Die Todesursache bei Mäusen, die während der VO mit Temsirolimus behandelt wurden, war jedoch nicht klar, da diese Tiere stark geschwächt waren und kurz nach der Verabreichung des Anästhetikums starben; Daher konnten wir den LVEDP für diese Gruppe nicht messen. Wir spekulierten jedoch, dass das niedrige Herzzeitvolumen des kleineren LV zu einem höheren LVEDP führen und für mit Temsirolimus behandelte AVF-operierte Mäuse tödlich sein würde, da die systolische Funktion, definiert durch echokardiographisch bestimmte LVDs und LVEF, in allen Gruppen erhalten blieb.

Die Rolle von mTOR bei der Hypertrophie des Skelettmuskels ähnelt der bei der exzentrischen Hypertrophie des Herzens33,34. Im Skelettmuskel ist Akt einer der Hauptvermittler der durch mechanische Dehnung induzierten mTOR-Aktivierung33, während andere Signale, einschließlich Aminosäuren, Ca2+ und Phosphatidsäuren, ebenfalls beteiligt sind34. Kürzlich wurde berichtet, dass der neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase (nNOS)/Ca2+/mTOR-Weg ein Schlüsselweg bei der dehnungsinduzierten Hypertrophie des Skelettmuskels ist16. Wir fanden heraus, dass die Akt-Hemmung durch MK-2206 die mTOR-Aktivierung während der VO aufhob, was ihre Bedeutung als Schlüsselmediator der mTOR-Signalübertragung unterstreicht, obwohl dies die Beteiligung anderer Faktoren nicht ausschließt.

In der Zwischenzeit muss der Aktivator für Akt während der VO noch endgültig geklärt werden, obwohl wir Kandidaten wie IGF, NRG-1 und CTGF identifiziert haben. NRG-1 wird aus den Endothelzellen der Mikrogefäße im Herzen freigesetzt35 und IGF wird aus Myozyten als Reaktion auf mechanische Dehnung freigesetzt36. Da es technisch schwierig war, die Sekretion dieser Wachstumsfaktoren in vivo während der VO zu untersuchen, haben wir ihre mRNA-Expression in der subakuten Phase (Tag 1 bis 14) gemessen. Daher ist der Beitrag dieser Wachstumsfaktoren zur Akt-mTOR-Aktivierung während VO, insbesondere in der akuten Phase (1–3 Stunden), nicht schlüssig. Es wurde zuvor berichtet, dass IGF-1 als Reaktion auf mechanische Dehnung in vitro schnell (innerhalb von 30 Minuten) aus Myozyten ausgeschieden wird36; Wir spekulierten daher, dass die Sekretion dieser Wachstumsfaktoren der Hochregulierung der mRNA vorausgehen und zur Aktivierung der Akt-mTOR-Achse in der akuten Phase (1–3 Stunden) beitragen würde. Es sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich, um die Rolle von Wachstumsfaktoren bei der Akt-mTOR-Aktivierung während VO zu bestätigen. Darüber hinaus könnte die K63-Ubiquitinierung von Akt als Reaktion auf VO einen Hinweis auf die Identifizierung des Aktivators der Akt-mTOR-Achse liefern. Aktuelle Berichte deuten darauf hin, dass IGF und epidermale Wachstumsfaktoren die K63-Ubiquitinierung von Akt regulieren, was zu seiner Rekrutierung an der Zellmembran führt und seine Phosphorylierung fördert26,27. Unsere Ergebnisse, die auf eine K63-Ubiquitinierung hinweisen, stimmen mit der Hochregulierung der IGF-1- oder NRG-1- und Akt-mTOR-Aktivierung überein. Es wäre lohnenswert, die Rolle nicht nur von IGF-1 und NRG-1, sondern auch der K63-Ubiquitinierung bei der Akt-mTOR-Aktivierung während VO weiter zu untersuchen. Zusätzlich zu IGF und NRG-1 könnte CTGF, von dem zuvor berichtet wurde, dass es Akt in isolierten neugeborenen Myozyten von Ratten aktiviert, zur Akt-mTOR-Aktivierung während VO37 beitragen. Neben diesen Wachstumsfaktoren untersuchten wir die Integrin-Linked Kinase (ILK), die Focal Adhäsion Kinase (FAK) und den G-Protein-gekoppelten Proteinrezeptor (GPCR), fanden jedoch keine eindeutigen Hinweise auf deren Beteiligung an der Akt-Aktivierung während VO (ergänzende Abbildung). S7a–c).

Da mTOR eine Schlüsselrolle beim Organwachstum spielt und die Organgröße bestimmt11,19,21, ist die exzentrische Hypertrophie, die hauptsächlich von der mTOR-Aktivität abhängt, analog zum Herzwachstum und die mTOR-Aktivität reguliert physiologisch die Größe des erwachsenen Herzens entsprechend der individuellen Herzgröße Körperbau und entsprechendes beanspruchtes Volumen (Vorspannung). Abgesehen von ihrer Rolle beim Herzwachstum spielt die Akt-mTOR-Achse eine Schlüsselrolle bei der durch körperliche Betätigung verursachten Hypertrophie38,39. Sport führt nicht nur zu einer verbesserten Kontraktilität und einer erhöhten Herzfrequenz, sondern auch zu einem verringerten arteriellen Widerstand und einem erhöhten Belastungsvolumen (Vorlast) mit einem leichten Anstieg des LVEDP40,41. Wir spekulierten, dass der Anstieg des Belastungsvolumens und des LVEDP während des Trainings Akt-mTOR aktivieren würde, was zu einer durch Training verursachten Hypertrophie führen würde, obwohl das Training, wie bereits erwähnt, eine zusammengesetzte Stimulation für das Herz erzeugt.

Wir haben gezeigt, dass die HW während der VO durch zeitliche Integration der mTOR-Aktivität genau geschätzt werden kann, basierend auf dem Beweis, dass die Geschwindigkeit des Fortschreitens der exzentrischen Hypertrophie proportional zur mTOR-Aktivität war, was die entscheidende Rolle von mTOR bei der exzentrischen Hypertrophie unterstreicht. Ein Grund dafür, dass diese einfache Berechnung die genaue Schätzung des HW während der VO ermöglicht, könnte die geringe Proliferationskapazität der Myozyten sein. Für andere Organe wäre ein komplexeres Modell erforderlich, da das Vorhandensein proliferativer Zellen zu einer Massenzunahme führen würde, die unabhängig vom Zellwachstum aufgrund der mTOR-Aktivität ist.

Obwohl wir uns in dieser Studie auf die Rolle von Akt-mTOR bei der exzentrischen Hypertrophie konzentrierten, ist die Rolle von Akt-mTOR bei der Herzfunktion ebenfalls ein interessantes Thema. Akt spielt durch verschiedene Signale eine Schlüsselrolle im überlebensfördernden Weg42,43 und mTORC1 reguliert die Herzfunktion und das Myozytenüberleben durch 4E-BP1-Hemmung44. Unsere vorläufigen Daten zeigten, dass Myozytenapoptose bei exzentrischer Hypertrophie während VO nicht erkennbar war, wie zuvor berichtet (ergänzende Abbildung S8). Daher haben wir in dieser Studie die Rolle der Akt-mTOR-Achse bei der Herzfunktion nicht weiter untersucht. Es wäre jedoch von großem Interesse, die Rolle der Akt-mTOR-Achse als Reaktion auf diastolischen Wandstress bei der Herzfunktion bei Myokardversagen zu untersuchen, bei dem es häufig zu Myozytenapoptose kommt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Akt-mTOR-Achse, die LVEDP-abhängig aktiviert wird, eine entscheidende Rolle beim Fortschreiten der exzentrischen Hypertrophie spielt. Da die exzentrische Hypertrophie ein inhärentes System des Herzens zur Regulierung des Herzzeitvolumens und des LVEDP ist, liefern unsere Ergebnisse neue mechanistische Einblicke in den Anpassungsmechanismus des Herzens.

Alle Verfahren mit Tieren und Tierpflegeprotokollen wurden vom Ausschuss für Ethik von Tierversuchen der Kyushu University Graduate School of Medical and Pharmaceutical Sciences (A26-053) genehmigt und in Übereinstimmung mit der Richtlinie für Tierversuche der Kyushu University und der durchgeführt Richtlinie für die Pflege und Verwendung von Labortieren, veröffentlicht von den US National Institutes of Health (überarbeitet im Jahr 2011). C57BL/6J-Mäuse (gekauft von Kyudo Co. Ltd., Saga, Japan) wurden in einem Raum mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit gehalten und mit einer kommerziellen Diät (CRF-1; Oriental Yeast Co. Ltd., Tokio, Japan) gefüttert. mit freiem Zugang zu Wasser. Das VO-Modell wurde durch Erstellen einer AVF wie zuvor beschrieben45 generiert. Kurz gesagt, 8 bis 10 Wochen alte männliche Mäuse wurden mit einer Mischung aus Medetomidin (0,3 mg/kg; Wako Chemicals, Osaka, Japan), Midazolam (4 mg/kg; Wako Chemicals) und Butorphanoltartrat (5 mg/kg) anästhesiert. kg; Wako Chemicals) gemäß institutionellen Empfehlungen oder mit 1,5–2 % Isofluran (Pfizer, New York, NY, USA) plus Butorphanoltartrat (5 mg/kg; Wako Chemicals) für Experimente innerhalb von 24 Stunden. Die Bauchaorta wurde abgeschnitten und mit einer Nadel von der arteriellen zur venösen Seite durchdrungen, und das Loch auf der arteriellen Seite wurde mit Cyanacrylat verschlossen. Vor dem Schließen des Bauchschnitts wurden den Mäusen intraperitoneal 0,2 ml normale Kochsalzlösung verabreicht, um den Flüssigkeitsverlust aufgrund der Blutung auszugleichen. Die erfolgreiche AVF-Erzeugung wurde durch die Beobachtung von rotem, sauerstoffhaltigem arteriellem Blut in der Vene zum Zeitpunkt der Operation und bei der Tötung bestätigt. Kontrollmäuse wurden einer Scheinoperation ohne AVF-Erzeugung unterzogen. Die Mäuse wurden vor der Tötung über 12 Stunden lang ausgehungert.

Unter leichter Anästhesie mit 1–2 % Isofluran wurden mit einem Vevo 2100-Ultraschallsystem (Visual Sonics, Toronto, Kanada) zweidimensionale gezielte M-Mode-Bilder aus der Kurzachsenansicht auf Papillarmuskelebene aufgenommen. Die LVEF wurde anhand der folgenden Formel berechnet, die im System vorprogrammiert war: LVEF = [(diastolisches LV-Volumen – systolisches LV-Volumen)/diastolisches LV-Volumen) × 100], wobei LV-Volumen = [(7,0/(2,4 + LV Durchmesser)] × LV-Durchmesser3. Die mittlere Wanddicke wurde als Mittelwert der Dicken des interventrikulären Septums und der linken ventrikulären Hinterwand gemessen. Die Hämodynamik wurde gemessen, während Mäuse leicht mit Tribromethanol-Amylenhydrat (2,5 % Avertin; 8) anästhesiert wurden μL/g Körpergewicht durch intraperitoneale Injektion; Sigma, St. Louis, MO, USA). Ein 1,4-Fr-Katheter mit Mikromanometerspitze (Millar Instruments Inc., Houston, TX, USA) wurde in die rechte Halsschlagader eingeführt und zur Druckmessung in den linken Ventrikel vorgeschoben. Die diastolische Wandspannung (σ) wurde aus dem LV-Durchmesser in der Diastole (LVDd) (d), der mittleren Wandstärke (h), gemessen durch Echokardiographie, und dem LVEDP (p) gemäß der Formel σ berechnet = d × p/4 h, unter Annahme einer sphärischen Geometrie. Nach den Messungen wurden die Mäuse mit einer Überdosis Natriumphenobarbital eingeschläfert.

Gefrorene Myokardgewebeproben wurden in RIPA-Puffer (Radioimmunpräzipitationsassay) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) homogenisiert, der einen Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA), 1 mM NaF und 0,1 mM Na3VO4 enthielt. Gleiche Proteinmengen (20 μg pro Spur) wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und dann unter Verwendung eines Trans-Blot-Geräts (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) elektrophoretisch auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. . Nach einstündigem Blockieren mit Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 wurde die Membran über Nacht bei 4 °C mit primärem Antikörper inkubiert, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit dem entsprechenden sekundären Antikörper bei Raumtemperatur. Primärantikörper von Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) gegen die folgenden Proteine ​​wurden verwendet: ribosomales Protein S6 (#2217), Phospho-S6Ser235/236 (#4858), Phospho-S6240/244 (#5364), eukaryotische Translation Initiationsfaktor 4E-Bindungsprotein (4E-BP; #9644), Phospho-4E-BPThr37/46 (#2855), Akt (#9272), Phospho-AktSer473 (#4060), prolinreiches Akt-Substrat 40 kDa (PRAS40; #2691), Phospho-PRASThr246 (#13175), K63-bindungsspezifisches Ubiquitin (#5621), gespaltene Caspase-3 (#9661) und Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP; #9542). Als Kontrolle wurde ein Antikörper gegen Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GADPH; sc-32233; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) verwendet.

Myokardgewebehomogenate wurden mit Akt-Antikörper (#9272) in RIPA-Puffer, der einen Proteaseinhibitor-Cocktail, 1 mM NaF, 0,1 mM Na3VO4 und 20 μM PR-619 enthielt, 1 Stunde lang bei 4 °C immunpräzipitiert. Protein-G-Sepharose-Kügelchen (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) wurden zu der Mischung gegeben und 1 Stunde bei 4 ° C inkubiert. Die Mischung wurde dreimal zentrifugiert und gewaschen. Jeder Probe wurde ein äquivalentes Volumen Probenpuffer zugesetzt. Nach dem Vortexen und Kochen wurden gleiche Volumina der Proben durch SDS-PAGE getrennt, gefolgt von Immunoblotting wie oben beschrieben.

Mit Temsirolimus-Lösung (Pfizer, New York, NY, USA) gefüllte osmotische Pumpen (ALZET, Cupertino, CA, USA) wurden den Mäusen subkutan implantiert. Der Akt-Inhibitor MK-2206 (Active Biochemicals Co., Hong Kong) wurde in 30 % Captisol (ChemScene, Monmouth Junction, NJ, USA) gelöst und oral verabreicht. Den Kontrollmäusen wurde das Vehikel verabreicht.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy Mini-Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) extrahiert und mit einem ReverTra Ace-Kit (Toyobo, Tokio, Japan) in cDNA umgewandelt. Die relative Expression jedes Zielgens wurde durch RT-qPCR aus cDNA gemessen, die 10 ng RNA entspricht, unter Verwendung von 12 pmol jedes Primers in einem 30-μl-Reaktionsvolumen. Die Reaktionen wurden in einem AB7500 Fast Real-Time PCR-System (Life Technologies, Rockville, MD, USA) durchgeführt. Als interne Kontrolle wurde das ribosomale 18S-RNA-Gen verwendet. Die Vorwärts- bzw. Rückwärts-Primersequenzen waren wie folgt: IGF-1, CTGGACCAGAGACCCTTTGC und GGACGGGGACTTCTGAGTCTT; IGF-2, GTG CTGCATCGCTGCTTAC und ACGTCCCTCTCGGACTTGG; NRG-1, GGCATCTGTATCGCCCTGTTG und TGAGGGCCATTCGCTATGTTC; CTGF, TGCAGACTGGAGAAGCAGAG und CGATTTTAGGTGTCCGGATG; PDGF-A, GCGACTCTTGGAGATAGACTCCGTA und CGTAAATGACCGTCCTGGTCTTG; PDGF-B, TGCTGAGCGACCACTCCATC und CTCGGGTCATGTTCAAGTCCA; PDGF-C, ACCCGGATTCTGCATCCACTAC und GTCCACCTGCCATCGATCTG; PDGF-D, GCGGAACTGTCAACTGGAAGTC und CTCTTGAAATGTCCAGGCTCAAAC; Atrogin-1, AACATGTGGGTGTATCGGATGG und TGATGTTCAGTTGTAAGCACACAGG; MuRF-1, TGTCTCACGTGTGAGGTGCCTA und CACCAGCATGGAGATGCAGTTAC; und 18S, TTCTGGCCAACGGTCTAGACAAC und CCAGTGGTCTTGGTGTGCTGA.

Mit der Simulink-Software (MathWorks, Natick, MA, USA) wurde eine Simulation mit den Zeitreihen der mTOR-Aktivität, LVEDP und LVDd durchgeführt. Wir haben die gemessenen mTOR-Aktivitäts-, LVDd- und LVEDP-Daten mit der Excel-Software (Microsoft, Redmond, WA, USA) linear oder kurvenangepasst und die angepassten Kurven wurden zur Erfassung mit 100 Punkten/Tag mit der Online-Software Graphcel v1.11 erneut abgetastet ein Datensatz für jeden Parameter, der dann als Eingabedaten für das Simulationsmodell verwendet wurde.

Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Um die Behandlungsgruppen zu vergleichen, verwendeten wir eine einfaktorielle Varianzanalyse (einfaktorielle ANOVA) gefolgt von einem Post-hoc-Test nach Tukey oder Dunnett. Die Überlebensanalyse wurde mit der Kaplan-Meier-Methode durchgeführt und die Überlebensunterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Log-Rank-Test bewertet. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Für die statistische Analyse wurde die JMP9-Software (SAS, Cary, NC, USA) verwendet.

Zitierweise für diesen Artikel: Ikeda, M. et al. Die Akt-mTOR-Achse ist ein zentraler Regulator der exzentrischen Hypertrophie bei Volumenüberlastung. Wissenschaft. Rep. 5, 15881; doi: 10.1038/srep15881 (2015).

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Wir danken K. Hirano für die technische Beratung und danken dem Research Support Center der Graduate School of Medical Sciences der Kyushu University für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI (Zuschussnummern 25670392, 24390198, 23220013 und 23591084), den Strategischen Fonds zur Förderung von Wissenschaft und Technologie des Ministeriums für Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie und Zuschüssen für wissenschaftliche Forschung unterstützt das japanische Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Soziales.

Abteilung für Herz-Kreislauf-Medizin, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu-Universität, Fukuoka, Japan

Masataka Ikeda, Tomomi Ide, Takeo Fujino, Yuka Matsuo, Shinobu Arai, Keita Saku, Takamori Kakino, Yasuhiro Oga, Akiko Nishizaki und Kenji Sunagawa

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MI, TF, YM, SA, KS, TK, YO und AN führten die Experimente durch. MI und TI haben die Experimente entworfen und das Manuskript erstellt. KS betreute das Projekt.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Dieses Werk ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe nichts anderes angegeben ist; Wenn das Material nicht unter der Creative-Commons-Lizenz enthalten ist, müssen Benutzer die Erlaubnis des Lizenzinhabers einholen, um das Material zu reproduzieren. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Nachdrucke und Genehmigungen

Ikeda, M., Ide, T., Fujino, T. et al. Die Akt-mTOR-Achse ist ein zentraler Regulator der exzentrischen Hypertrophie bei Volumenüberlastung. Sci Rep 5, 15881 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15881

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Eingegangen: 10. Juni 2015

Angenommen: 01. Oktober 2015

Veröffentlicht: 30. Oktober 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15881

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