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May 26, 2023

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Virology Journal Band 20, Artikelnummer: 142 (2023) Diesen Artikel zitieren 524 Zugriffe 3 Altmetric Metrics Details SARS-CoV-2 hat seit Dezember 2019 eine weltweite Pandemie verursacht und die Suche nach

Virology Journal Band 20, Artikelnummer: 142 (2023) Diesen Artikel zitieren

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SARS-CoV-2 hat seit Dezember 2019 eine weltweite Pandemie verursacht und die Suche nach pharmazeutischen Angriffspunkten gegen COVID-19 bleibt eine große Herausforderung. Hier untersuchten wir das Hüllprotein E von SARS-CoV und SARS-CoV-2, ein hochkonserviertes Viroporin mit 75–76 Aminosäuren, das für die Virusassemblierung und -freisetzung entscheidend ist. E-Proteinkanäle wurden rekombinant in HEK293-Zellen exprimiert, ein membrandirigierendes Signalpeptid sorgte für den Transfer zur Plasmamembran.

Die Viroporinkanalaktivität beider E-Proteine ​​wurde mithilfe der Patch-Clamp-Elektrophysiologie in Kombination mit einem Zelllebensfähigkeitstest untersucht. Wir haben die Hemmung durch die klassischen Viroporin-Inhibitoren Amantadin, Rimantadin und 5-(N,N-Hexamethylen)-Amilorid überprüft und vier Ivermectin-Derivate getestet.

Klassische Inhibitoren zeigten eine starke Aktivität in Patch-Clamp-Aufzeichnungen und Lebensfähigkeitstests. Im Gegensatz dazu hemmten Ivermectin und Milbemycin den E-Kanal in Patch-Clamp-Aufzeichnungen, zeigten jedoch nur eine mäßige Aktivität auf das E-Protein im Zelllebensfähigkeitstest, der auch empfindlich auf die allgemeine zytotoxische Aktivität der getesteten Verbindungen reagiert. Nemadectin und Ivermectin-Aglycon waren inaktiv. Alle Ivermectin-Derivate waren bei Konzentrationen > 5 µM zytotoxisch, also unterhalb des für die E-Protein-Hemmung erforderlichen Wertes.

Diese Studie zeigt eine direkte Hemmung des SARS-CoV-2-E-Proteins durch klassische Viroporin-Inhibitoren. Ivermectin und Milbemycin hemmen den E-Protein-Kanal, ihre Zytotoxizität spricht jedoch gegen eine klinische Anwendung.

Coronaviren waren für schwere Ausbrüche der Atemwegserkrankungen SARS, MERS und die durch SARS-CoV-2 verursachte COVID-19-Epidemie im Jahr 2019 verantwortlich [1]. Eine schwere Infektion mit SARS-CoV-2 führt zu einer schweren Beeinträchtigung der Lungenfunktion, die häufig mit einer systemischen Entzündung und einer massiven Freisetzung entzündlicher Zytokine, dem so genannten Zytokinsturm [2,3,4], einhergeht, der auch bei anderen virusbedingten Erkrankungen bekannt ist [5,6,7]. Eine weltweite Impfkampagne war unerlässlich, um die Ausbreitung von COVID-19 einzudämmen. Dennoch sind neue Stämme von SARS-CoV-2 aufgetaucht, und es besteht weiterhin die Gefahr des Auftretens neuer Stämme, die teilweise [8] oder sogar vollständig resistent sind zu aktuellen Impfstoffen. Neben der Infektionsprävention durch Impfung ist eine wirksame Behandlung infizierter Patienten eine wesentliche Notwendigkeit im Kampf gegen SARS-CoV-2.

SARS-CoV-2 ist ein umhülltes, einzelsträngiges Positiv-Sense-RNA-Virus mit 14 offenen Leserahmen in seinem Genom. Diese kodieren für Strukturproteine, die das Viruskapsid bilden, einschließlich des Spike-Proteins (S), des Membranproteins (M), des Hüllproteins (E) und des Nukleokapsidproteins (N), sowie für nichtstrukturelle Proteine, einschließlich derjenigen von der virale Replikase- und Proteaseapparat sowie akzessorische Proteine ​​[3].

Das Hüllprotein E und das ORF3a-Protein von SARS-CoV-2 gehören zur Klasse der Viroporine, einer Gruppe meist kleiner, hydrophober integraler Membranproteine, die sich zu Membrankanälen zusammenfügen, die sich normalerweise in intrazellulären Membranen des ER- und Golgi-Apparats befinden [9 ,10,11]. Da Viroporine für die Virusreplikation und -freisetzung unerlässlich sind, sind sie in der Tat brauchbare Ziele für antivirale Medikamente [9, 10, 12, 13]. Das erste gut charakterisierte Viroporin war der M2-Kanal des Influenza-A-Virus [14,15,16]. Weitere Viroporine sind der p7-Kanal von Hepatitis C [17, 18] und das virale Protein U des humanen Immundefizienzvirus [19]. Viroporine sind auf zwei Arten am viralen Infektionszyklus beteiligt: ​​(i) sie verursachen ionische Ungleichgewichte und stören pH-Gradienten durch ihre Wirkung als intrazelluläre Ionenkanäle und (ii) indem sie zelluläre Pfade durch Protein-Protein-Wechselwirkungen stören [2, 9, 12, 20].

E-Proteine ​​kommen in allen Coronaviren vor und trotz Variationen in der Proteingröße (75–109 Aminosäuren) und der Sequenz [21] ist ihre Struktur hoch konserviert, einschließlich eines kurzen N-terminalen Segments und eines langen Alpha-Helix-Abschnitts, der wahrscheinlich eine Transmembran umfasst Domäne und einen unstrukturierten Carboxyterminus [9]. Die Sequenz des E-Proteins ist zwischen SARS-CoV (1-E) und SARS-CoV-2 (2-E) hoch konserviert und unterscheidet sich durch eine Deletion und drei ausgetauschte Reste, die sich alle in der Nähe des C-terminalen Endes befinden Protein mit 76 Aminosäuren.

Studien zum rekombinant exprimierten SARS-CoV-E-Protein identifizieren das Protein an der Zellplasmamembran [22], dies konnte jedoch in späteren Studien nicht bestätigt werden [23]. Die Viroporin-Kanalaktivität wurde mithilfe planarer Lipiddoppelschichten und Mizellen bestätigt, in denen das E-Protein oligomere Strukturen bildet, die die Ionenkanalpore bilden [22, 24, 25].

Das Genom von SARS-CoV kodiert für drei mutmaßliche Viroporine, das E-Protein, die Proteine ​​ORF3a und ORF8a [12]. Für eine maximale Replikation und Virulenz von SARS-CoV ist die Aktivität der E- und 3a-Proteine ​​erforderlich, wobei die Lebensfähigkeit des Virus verringert wird, wenn eines der beiden Viroporine inaktiv ist, und ein vollständiger Verlust der Virusreplikation auftritt, wenn beide nicht vorhanden sind. Im Gegensatz dazu war das ORF-8a-Protein für die Virusaktivität nicht erforderlich [12]. Dieselbe Studie zeigte in einem Mausmodell einer SARS-CoV-Infektion, dass sowohl die Ionenkanalaktivität des E-Proteins als auch intrazelluläre Interaktionen, die durch sein PDZ-Bindungsmotiv vermittelt werden, für die Virulenz notwendig sind [12]. Die Deletion des E-Gens in verschiedenen Coronaviren führt zu einer verringerten Virusreifung und -freisetzung, zur Produktion von Viren mit geringer Virulenz und zu einer Verringerung von zellulärem Stress und virusinduzierter Apoptose [26, 27]. Sowohl das E- als auch das ORF3a-Protein von SARS-CoV und SARS-CoV-2 weisen eine hohe Sequenzkonservierung und eine ähnliche Funktion auf, während ORF8-Proteine ​​nicht als Viroporine identifiziert wurden [9]. Somit sind sowohl E als auch ORF3a brauchbare pharmazeutische Ziele [12, 26], und ein Inhibitor oder eine Kombination von Inhibitoren, die beide Viroporine angreifen können, wären ein vielversprechendes therapeutisches Instrument zur Behandlung von COVID-19.

Zu den klassischen Viroporin-Inhibitoren gehören Amantadin und Rimantadin [18, 28, 29], 5-(N,N-Hexamethylen)amilorid (HMA) [22, 30] und mehrere Iminozuckerderivate [29, 31]. Kürzlich haben wir gezeigt, dass einige Mitglieder der Flavonoidfamilie Inhibitoren rekombinanter SARS-CoV-E-Proteinkanäle sind [32].

Ivermectin, ein gut charakterisiertes Anthelminthikum und Ionenkanalmodulator [33, 34], wurde in zahlreichen Studien auf seinen möglichen Einsatz im Kampf gegen SARS-CoV-2 untersucht [35], die Ergebnisse sind jedoch nicht eindeutig, da einige Aktivitäten nur bei beobachtet wurden Einige Infektionszustände [36,37,38,39] und Ivermectin-assoziierte Toxizität schränken die klinische Anwendung ein, ähnlich seiner Wirkung gegen das Newcastle-Virus [36]. Hier haben wir Ivermectin und drei seiner Derivate, nämlich Nemadectin, Milbemycin und Ivermectin-Aglycon, auf ihre Aktivität gegen das in HEK293-Zellen exprimierte rekombinante E-Protein von SARS-CoV-2 getestet. In Zelllebensfähigkeitsstudien wurde die Wirkung von Ivermectin auf die E-Protein-Aktivität festgestellt, die jedoch nicht von der Zytotoxizität von Ivermectin selbst getrennt werden konnte. In elektrophysiologischen Patch-Clamp-Studien war Ivermectin ein starker Inhibitor des E-Proteins, Milbemycin zeigte ebenfalls Aktivität, während die Hemmung durch Ivermectin-Aglycon weniger ausgeprägt war und Nemadectin inaktiv war. Somit identifizieren wir das E-Protein von SARS-CoV-2 als direktes pharmakologisches Ziel für Viroporin-Inhibitoren. Während bestätigt wurde, dass einige Ivermectin-Derivate wirksame Inhibitoren des E-Protein-Kanals sind, ist die klinische Anwendbarkeit dieser Verbindungen durch ihre Zytotoxizität begrenzt.

Erzeugung des SARS-CoV-2-E-Proteinkonstrukts cDNA, die das E-Protein von SARS-CoV (1-E) kodiert [32], wurde als Vorlage verwendet, um die erforderlichen Mutationen (T55S, V56F, E69R, G70del) einzuführen, um ein Plasmid zu erzeugen Kodierung des SARS-CoV-2 E-Proteins (2-E) mithilfe ortsgerichteter Mutagenese durch ein Overlap-Extension-PCR-Protokoll [18]. 2-E-cDNA wurde unter Verwendung von EcoRI- und PstI-Restriktionsstellen in den pRK5-Vektor eingefügt. Für elektrophysiologische Messungen wurde ein membrandirigierendes Signalpeptid „MWTPRVPPPRPALSFFLLLLLGVTYGLFPEEPPPLSVAE“ aus murinem Semaphorin-6B, gefolgt von einem Myc-Tag für die Western-Blot-Analyse, an den N-Terminus des E-Proteins fusioniert. Alle Konstrukte wurden durch Sequenzierung verifiziert. E-Protein wurde in HEK293-Zellen für Western-Blot-Analysen, MTT-Assays und elektrophysiologische Messungen exprimiert.

Zellkultur und Transfektion HEK293-Zellen (ATCC, LGC Standards GmbH, Wesel, Deutschland) wurden in 10-cm-Gewebekulturschalen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, Kairo, Ägypten), ergänzt mit 10 % FBS (Invitrogen, Karlsruhe), kultiviert , Deutschland) und 1000 IE Penicillin/Streptomycin (Sigma-Aldrich, Kairo, Ägypten) bei 5 % CO2 und 37 °C in einer wassergesättigten Atmosphäre.

Western-Blot-Analyse: Zellen wurden in 6-cm-Platten ausplattiert und mit 4 µg cDNA und 12 µg PEI pro Platte transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurden HEK293-Zellen geerntet, eine rohe Membranfraktion durch zwei Homogenisierungsrunden und anschließende 20-minütige Zentrifugation bei 14.000 g hergestellt und einer SDS-PAGE und einem Western Blot unterzogen. Ein polyklonaler Kaninchen-Anti-c-myc-Primärantikörper (Proteintech, Martinsried, Deutschland) und ein mit alkalischer Phosphatase konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Proteintech, Martinsried, Deutschland) wurden verwendet und der Blot unter Verwendung von 0,03 % Nitroblau-Tetrazolium und 0,02 visualisiert % 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat in Substratpuffer (100 mM Tris-HCl, pH 9,5; 100 mM NaCl; 5 mM MgCl2). Da das E-Protein instabil war und schnell abgebaut wurde, wurden alle Vorgänge unmittelbar nach der Ernte unter Verwendung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Proteaseinhibitoren (Roche C@mplete, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) durchgeführt und 2 Jahre lang auf 95 °C erhitzt min unmittelbar vor dem Laden des SDS-Gels. Dadurch wird der Abbau minimiert, allerdings werden die Oligomere bei dieser Behandlung nicht vollständig abgetrennt. Die Proteinkonzentration wurde mit einem Qbit-Assay (Thermofisher, Karlsruhe, Deutschland) bestimmt und pro Spur wurden 20 μg Gesamtprotein aufgetragen.

Zelloberflächen-Expressionstest HEK293-Zellen wurden mit cDNA-Konstrukten transfiziert, die für myc-markiertes SARS-CoV-2 E-Protein (2-E) und SARS-CoV-2 E-Protein mit membrandirigierendem Signalpeptid (2E–SP) kodieren. Als Kontrolle dienten nicht transfizierte HEK293-Zellen und mit GFP transfizierte Zellen. Lebende Zellen wurden 1 Stunde lang mit einem primären Kaninchen-Anti-Myc-Antikörper und dann 30 Minuten lang mit einem sekundären alkalischen Phosphatase-gekoppelten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper inkubiert. Anschließend wurden die Zellen geerntet, homogenisiert und die Zellsuspension auf die Vertiefungen eines Dot-Blot-Geräts aufgetragen. Der Blot wurde mit NBT/BCIP entwickelt und analysiert. Die Pixelintensität wurde mit der ImageJ-Software ohne weitere Korrektur der Rohdaten quantifiziert. Die Pixelintensitäten für jeden Peak wurden auf die Gesamtpixelintensität aller Peaks normiert. Es wurden Mittelwerte aus doppelten Messwerten aus drei unabhängigen Expressionsexperimenten gebildet (n = 6). Zur Anzeige (Abb. 1E) wurde die Hintergrundintensität (nicht transfizierte Zellen) von den aufgezeichneten Spotintensitäten abgezogen.

Ein in dieser Studie verwendetes Ivermectin-Derivat. B Sequenzalignment von E-Proteinen aus SARS-CoV (1-E), SARS-CoV-2 (2-E) und neueren 2-E-Varianten. Die Kästchen zeigen die vier Positionen des Unterschieds zwischen 1-E (orange) und 2-E, die gelbe Farbe zeigt Aminosäureaustausche an, die in 2-E neuer SARS-CoV-2-Varianten gefunden wurden. C Strukturmodell des CoV-E-Proteins in der Seitenansicht und in der Draufsicht (PDB-Code: 5 × 29), bestimmt durch NMR-Spektroskopie in Lyso-Myristoyl-Phosphatidyl-Glycerol-Mizellen [59] Die fünf Untereinheiten sind farblich gekennzeichnet; die N- und C-terminalen Reste sind nur für eine Untereinheit markiert. D Western-Blot-Analyse von 2-E-Protein und Kontroll-Viroporinen, exprimiert in HEK293-Zellen. Alle Viroporine hatten einen N-terminalen Myc-Tag. Vor dem Beladen wurden die Proben kurz auf 95 °C erhitzt, um den Abbau zu minimieren, die Multimere wurden jedoch nicht vollständig getrennt. Die Färbung wurde mit einem primären Anti-Myc-Antikörper und einem AP-konjugierten sekundären AB durchgeführt. Spur 1: Leiter (ROTI®Mark TRICOLOR: 10, 15, 20, 25, 35, 45, 60, 75); Spur 2: GFP; Spur 3: SARS-CoV-2 E-Protein plus Signalpeptid; Spur 4: SARS-CoV-2 E-Protein ohne Signalpeptid; Spur 5: SARS-CoV E-Protein ohne Signalpeptid; Spur 6: Hepatitis-C-Virus p7-1a; Spur 7: SARS-CoV-2 ORF3a. Erwartete Molekulargewichte (kD): SARS-CoV-2 E: 12,6; SARS-CoV-2 E + SP: 16,8, Hepatitis-C-Virus p7-1a: 11,3; SARS-CoV-2 ORF 3a: 35,6 kD Signalpeptid (SP): 4,2; SARS-CoV-2 E-Dimer: 25,2; Trimer: 37,8 kD; Hepatitis-C-Virus-p7-1a-Dimer: 22,6; Trimer: 33,9. Beachten Sie, dass ein Immunsignal nur bei myc-markierten Antikörpern beobachtet wird. Kleine Viroporine wandern nicht auf die gleiche Weise wie globuläre Markerproteine. Vorgeschlagene Oligomere (●, ●●, ●●●) und Abbaubanden (x) sind zwischen den Spuren 3 und 4 für E-Proteine ​​und rechts von Spur 6 und 7 für p7-1a bzw. ORF3a angegeben. E-Oberflächen-Expressionsanalyse: HEK293-Zellen wurden mit cDNA transfiziert, die für E-Protein (E) und E-Protein mit membrandirigierendem Signalpeptid (E-SP) kodiert. Als Kontrolle wurden nicht transfizierte und scheintransfizierte Zellen verwendet. Linkes Feld: Dot-Blot. Rechtes Feld: Quantifizierung der Blot-Intensitäten, Durchschnitt ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Experimenten mit zwei Spots pro Behandlung (n = 6). Der Y-Achsenbruch liegt zwischen 0,001 und 0,02. Das Hintergrundsignal (nicht transfizierte Zellen = keine DNA) wurde von den Spotintensitäten abgezogen; p-Werte sind angegeben, **: p < 0,01, ns: nicht signifikant, p > 0,05 (einfaktorielle ANOVA)

Zelllebensfähigkeitstest Zelllebensfähigkeitstests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [29]. Kurz gesagt, die HEK293-Zellsuspension wurde in 96-Well-Platten ausgesät und einen Tag nach dem Ausplattieren mit 0,3 µg DNA und 0,6 µg PEI pro Well transfiziert. Stamminhibitor (5 µl Endvolumen) in verschiedenen Konzentrationen wurde zugegeben und nach drei Tagen wurde wie beschrieben ein MTT-Test (3-(4,5-Dimethylthazolk-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) durchgeführt [29]. Lebensfähige Zellen produzieren ein violett gefärbtes Formazan-Derivat von MTT, das durch vorsichtiges Entfernen der MTT-Lösung und Zugabe von 100 µl DMSO pro Vertiefung gelöst wurde. Die Extinktionen bei 595 nm wurden mit einem Victor-3-Plattenlesegerät (Perkin-Elmer, Berlin, Deutschland) aufgezeichnet. Die Lebensfähigkeit der mit dem 2-E-Expressionskonstrukt transfizierten Zellen wurde auf Kontrollzellen normalisiert, die mit dem leeren pRK5-Vektor transfiziert waren. Die Hintergrundabsorption (200 mM KCl) wurde abgezogen. Als nächstes teilten wir die Testwerte durch die Kontrollwerte (scheintransfizierte Zellen) auf und normalisierten so die Kontrolldaten auf den Wert 1. Wir verglichen E-Protein von SARS-CoV und SARS-CoV-2 unter identischen Versuchsbedingungen. Zu den zusätzlichen Kontrollen gehörten: (1) GFP-transfizierte Zellen zur Überprüfung einer effizienten Transfektion; (2) Vergleich von nicht transfizierten Zellen mit pRK5-transfizierten Zellen, um die Auswirkung der Transfektion auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu identifizieren; (3) Zugabe von 200 mM KCl zur Auslösung des vollständigen Zelltods. (4) Um zu testen, ob die Inhibitoren einen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen hatten, wurden sie auch scheintransfizierten Zellen (mit leerem Vektor) zugesetzt. Die Zelllebensfähigkeit von mit Inhibitor behandelten Zellen, die mit E-Protein transfiziert wurden, wurde auf die Lebensfähigkeit von Kontrollzellen normalisiert, die mit der gleichen Inhibitorkonzentration behandelt wurden.

Elektrophysiologische Aufzeichnungen und Datenanalyse. Die Zellen wurden auf mit Aceton behandelten Glasdeckgläsern in 24-Well-Platten ausplattiert und einen Tag nach der Passage mit 1 µg E-Protein-cDNA, 1 µg grüner Fluoreszenzprotein (GFP)-cDNA und 3 µl Polyethylenimin (PEI) (1) transfiziert mg/ml) (Sigma-Aldrich, Kairo, Ägypten) pro Vertiefung. Patch-Clamp-Aufzeichnungen wurden 2–3 Tage nach der Transfektion durchgeführt. Zur Aufzeichnung wurden die Zellen in einer Badelösung (externer Puffer) gehalten, die 135 mM NaCl, 5,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,0 mM MgCl2 und 10 mM Hepes (pH 7,4 mit NaOH) enthielt. Aufnahmepipetten wurden aus Borosilikatglas (World Precision Instruments, Berlin, Deutschland) mit einem Horizontalzieher Sutter P-97 (Sutter, Novato, CA) gezogen. Der intrazelluläre Puffer bestand (in mM) aus 140 CsCl, 1,0 CaCl2, 2,0 MgCl2, 5,0 EGTA und 10 Hepes (pH-Wert mit CsOH auf 7,2 eingestellt). Kontrollzellen wurden mit dem mit GFP cotransfizierten pRK5-Vektor transfiziert und mit mit E-Protein und GFP transfizierten Zellen verglichen. Die Aktivität des E-Proteinkanals wurde anhand der Strom-Spannungs-Beziehungen anhand einer Spannungsrampe im Bereich von –60 mV bis +50 mV in 10-mV-Schritten bewertet. Zur Messung der Hemmung wurden die Testverbindungen dem extrazellulären Bad zugesetzt. Es wurden mindestens 6 Zellen pro Bedingung aufgezeichnet und gemittelt.

Um die Funktion und Hemmung der E-Proteine ​​von SARS-CoV (1-E) und SARS-CoV-2 (2-E) zu vergleichen, haben wir 2-E-Konstrukte generiert, indem wir den Austausch/die Entfernung der vier Positionen eingeführt haben, die zwischen 2 unterschiedlich sind -E und 1-E. Zusätzlich zu den klassischen Viroporin-Inhibitoren Amantadin, Rimantadin und HMA wurden Ivermectin und drei seiner Derivate, nämlich Ivermectin-Aglycon, Nemadectin und Milbemycin, getestet (Abb. 1A). Ein Sequenzabgleich zwischen SARS-CoV und allen CoV-2-Varianten zeigt eine hohe Konservierung zwischen E-Proteinen und identifiziert die vier von 76 Resten, die zwischen 1-E und 2-E ausgetauscht werden (Abb. 1B). Das Protein weist eine pentamere Struktur mit einer zentralen Pore auf (Abb. 1C) und der C-Terminus – der die vier Austauschstellen enthält – jeder Untereinheit zeigt von der Kanalpore weg. Die rekombinante Expression von 1-E wurde bereits gezeigt [32]. Das 2-E-Protein wurde in HEK293-Zellen exprimiert und die Western-Blot-Analyse bestätigte die Expression des Zielproteins (Abb. 1D). Um den Transport von E-Proteinkanälen zur Zelloberfläche zu fördern, wurde ein membrandirigierendes Signalpeptid hinzugefügt. Ein Western-Blot von 2-E mit oder ohne fusioniertes Signalpeptid (Abb. 1D) zeigte Immunsignale, die dem 2-E-Protein als Monomer, Dimer und mögliche Trimer entsprechen. Kontrollen waren das p7-1a-Viroporin des Hepatitis-C-Virus, das ebenfalls Oligomere zeigte, und das SARS-CoV-2-ORF3a [40]. Aufgrund der Instabilität des E-Proteins wurde die Membranvorbereitung in Gegenwart von Proteaseinhibitoren durchgeführt und die Proben vor der Beladung nur kurz erhitzt, um einen Abbau zu verhindern (siehe Methoden). Durch diese Behandlung blieb das E-Protein-Signal erhalten, die Oligomere wurden jedoch nicht vollständig abgetrennt. Selbst dann konnten deutliche Degradationsbanden beobachtet werden (Abb. 1D). Das 2-E-SP-Konjugat zeigte nur eine Bande in der erwarteten Monomerregion, aber keine Bande für das an das Signalpeptid konjugierte E-Protein, was auf eine effiziente Spaltung des Signalpeptids hinweist. Insgesamt deutet das Experiment auf eine erfolgreiche rekombinante Expression des E-Proteins in HEK 293-Zellen hin. Die Zelloberflächenexpression wurde durch einen Dot-Blot-Assay (Abb. 1E) verifiziert, bei dem die Zellen zunächst mit 2-E-Konstrukten transfiziert und lebende Zellen mit primären (Anti-Myc) und sekundären Antikörpern behandelt wurden, bevor die Zellen lysiert und direkt auf einen Blot aufgetragen wurden Membran. Auf diese Weise war für den Antikörper nur Protein auf der äußeren Zelloberfläche zugänglich. Dot-Blots zeigten ein Immunsignal auf der Zelloberfläche, was die Plasmamembranexpression bestätigte, und zeigten, dass die Zelloberflächenexpression für das 2-E-Protein, das das Signalpeptid enthielt, am höchsten war (Abb. 1E).

Aktivität des E-Proteins Wir verglichen die Aktivität des E-Proteins von SARS-CoV mit seiner neuen Variante von SARS-CoV-2 in einem Zelllebensfähigkeitstest und elektrophysiologischen Patch-Clamp-Messungen. Die Kontrolle für beide Experimente waren mit leerem Vektor transfizierte Zellen, die ansonsten auf die gleiche Weise wie im Testexperiment behandelt wurden. Im Zelllebensfähigkeitstest schwächte das Vorhandensein von aktivem E-Protein die Zellen und beschädigte sie schließlich, so dass eine verringerte Zelllebensfähigkeit auf E-Protein-Aktivität hinweist. Tatsächlich unterschieden sich die beobachteten Lebensfähigkeiten von HEK293-Zellen, die E-Protein oder ein Kontrollkonstrukt exprimierten, signifikant, wobei das E-Protein zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit transfizierter Zellen führte (Abb. 2). Die Aktivitäten beider E-Proteine ​​waren nahezu identisch, beide reduzierten den Anteil lebensfähiger Zellen auf etwa die Hälfte des Niveaus der Kontrolle (Lebensfähigkeitsniveaus Kontrolle: 1,00 ± 0,16, 1-E = 0,51 ± 0,17, 2-E = 0,52 ± 0,17, Abb. 2A).

Ein Vergleich von SARS-CoV 1-E und 2-E, analysiert durch MTT-Assay. Die Extinktionen bei 595 nm wurden auf die Scheinkontrolle (pRK-Vektor) normalisiert. B Elektrophysiologische Messungen an transfizierten HEK293-Zellen. 1-E (gekreuztes Quadrat) und 2-E (ausgefülltes Quadrat) transfizierte Zellen wurden mit Mock-transfizierten Kontrollzellen (leerer pRK-Vektor, leere Kreise) verglichen. Fehlerbalken sind Standardabweichungen (SD); Die Anzahl der Zellen betrug 16 (pRK) und 14 (1-E, 2-E). C Zusammenfassung der elektrophysiologischen Daten: durchschnittliche Ströme bei − 60 mV werden angezeigt ± Standardabweichung, Signifikanz (einfaktorielle ANOVA) ist angegeben, *: p < 0,05, **: p < 0,01

Anschließend verglichen wir die Kanalaktivität beider E-Proteine ​​mithilfe der Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, bei der die Transmembrankanalaktivität, dh der Ionenfluss durch die Membran, direkt gemessen wird. Wir haben Strom-Spannungs-Beziehungen im Bereich von −60 bis +50 mV analysiert. Kontrollzellen zeigten Hintergrundströme (Leckströme) von –0,98 ± 0,05 nA bei –60 mV. Die Expression des E-Proteins sollte aufgrund seiner Kanalaktivität größere Ströme induzieren. Wie erwartet waren die Ströme nach der Viroporinexpression im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht (Abb. 2B). Beim Vergleich beider E-Proteine ​​unter identischen Bedingungen waren die 2-E-vermittelten Ströme etwas geringer, dieser Unterschied war jedoch nicht signifikant (1-E = 1,45 ± 0,07 nA, 2-E = 1,35 ± 0,11 nA, p = 0,28).

Hemmung durch Rimantadin, Amantadin und HMA Wir untersuchten die Aktivität klassischer Viroporin-Inhibitoren auf das 2-E-Protein und verglichen sie mit der zuvor veröffentlichten Wirkung des 1-E-Proteins [32]. Im Zelllebensfähigkeitstest zeigten die 2-E-Proteinexpression in HEK293-Zellen und die Hemmung mit Rimantadin, Amantadin und HMA IC50-Werte von 8,9 ± 2,2 µM, 89 ± 27 µM bzw. 1,5 ± 0,3 µM (Abb. 3A, B). Diese Aktivitäten waren vergleichbar mit den Hemmdaten des veröffentlichten 1-E-Proteins (IC50 von Rim = 10,9 ± 3,3 µM, Ama = 77 ± 13 µM, HMA = 2,6 ± 0,4 µM) [32]. Während Amantadin und Rimantadin im getesteten Konzentrationsbereich nicht zytotoxisch waren, zeigte HMA, wie bereits berichtet, bei Konzentrationen > 10 µM zytotoxische Wirkungen [29, 41]. Elektrophysiologische Messungen an 2-E-exprimierenden HEK293-Zellen (Abb. 3C) zeigten das gleiche Aktivitätsmuster für alle klassischen Inhibitoren, wobei HMA am aktivsten war, gefolgt von Rimantadin und Amantadin am wenigsten aktiv (Rim IC50 = 3,6 ± 0,6 nM, Ama IC50 = 24,1 ± 6,5 nM, HMA IC50 = 1,9 ± 0,3 nM, Abb. 3 D, E). Es wird darauf hingewiesen, dass die Patch-Clamp-Elektrophysiologie aufgrund der membransteuernden Signalsequenz direkt an den Zellen durchgeführt wurde, in denen das E-Protein in der äußeren Plasmamembran vorhanden war. Diese experimentelle Konfiguration ermöglicht eine direkte Interaktion des E-Proteinkanals und des Inhibitors. Die aus Patch-Clamp-Experimenten ermittelten IC50-Werte der Inhibitoren sind daher viel kleiner als die aus zellulären Tests erhaltenen Werte, bei denen der Inhibitor zunächst in die Zellen eindringen muss, bevor er an sein Ziel bindet. Beim Vergleich der Patch-Clamp-Hemmungsdaten von 2-E mit denen von 1-E beobachteten wir das gleiche Muster der Hemmwirkung (HMA > Rimantadin > Amantadin) für beide Kanäle, während es einen kleinen Unterschied im Ausmaß der Hemmung gab reduzierte Aktivität für 2-E im Vergleich zu 1-E (Faktor ~ 2).

Hemmung des 2-E-Proteins durch die klassischen Viroporin-Inhibitoren Rimantadin (Rim), Amantadin (Ama) und Hexamethylenamilorid (HMA). Ein Zelllebensfähigkeitstest. Die relative Absorption wurde auf die Kontrolle normalisiert (Scheintransfektion). B Zusammenfassung der IC50-Daten. C Strom-Spannungs-Verhältnis von rekombinant exprimiertem 2-E in HEK293-Zellen. Die Transmembranspannung wurde in 10-mV-Intervallen im Bereich von –60 bis +50 mV abgestuft und die damit verbundenen Ströme aufgezeichnet. Die Kontrollen waren scheintransfizierte HEK293-Zellen (leerer pRK-Vektor). Die Expression von 2-E führte zu erhöhten Strömen, die in Gegenwart des Inhibitors verringert wurden. Die Tafeln von links nach rechts repräsentieren Rim, Ama und HMA. Die Konzentrationen sind in der Abbildung angegeben. D Strom-Spannungs-Beziehungen für Rim, Ama und HMA wurden in eine IC50-Kurve bei −60 mV umgewandelt und zwischen Irel = 0 (scheintransfiziert) und Irel = 1 (SARS-CoV-2 E-Protein ohne Inhibitor) normalisiert; Irel = relativer Strom. E Zusammenfassung der IC50-Daten von Rim, Ama und HMA aus der Patch-Clamp-Elektrophysiologie

Hemmung durch Ivermectin und Derivate Als Kontrolle untersuchten wir die Wirkung von Ivermectin, Ivermectin-Aglycon, Milbemycin und Nemadectin auf scheintransfizierte HEK293-Zellen in einem Zelllebensfähigkeitstest. Alle Ivermectin-Derivate zeigten eine bemerkenswerte Zytotoxizität. Der Beginn der Zelltoxizität variierte zwischen den Experimenten und war bei Nemadectin am ausgeprägtesten, wo Zellschäden bereits bei 2 µM beobachtet wurden (Abb. 4A). Die Inhibitorkonzentrationsbereiche (0,2–2 µM für Ivermectin und Milbemycin; 0,5–5 µM für Ivermectin-Aglycon und Nemadectin) wurden auf der Grundlage gleichzeitig durchgeführter elektrophysiologischer Daten ausgewählt, die höhere Aktivitäten für Ivermectin und Milbemycin als für Ivermectin-Aglycon und Nemadectin zeigten. Bei allen Ivermectin-Derivaten war die Hemmung des 2-E-Proteins im Zelllebensfähigkeitstest (Abb. 4B) weniger ausgeprägt als in früheren Tests für klassische Inhibitoren oder Flavonoide [32]. Nur Ivermectin zeigte bei der höchsten getesteten Konzentration (2 µM) hemmende Wirkungen. Ein Grund für die verringerte scheinbare Hemmwirkung von Ivermectin-Derivaten könnte die Toxizität der Verbindungen selbst sein, die die Hemmwirkung überlagert. Außerdem sind Ivermectin und die Derivate membrangebunden und erreichen den intrazellulären Zielort an der ER-Golgi-Membran möglicherweise nicht leicht. Bei elektrophysiologischen Messungen sind Toxizitätsaspekte irrelevant, da alle Wirkstoffkonzentrationen viel geringer und daher ungiftig sind, während die zweite mögliche Einschränkung im Zelllebensfähigkeitstest – Ivermectin erreicht seinen intrazellulären Bestimmungsort nicht – hier nicht zutrifft, da Viroporine exponiert sind die äußere Plasmamembran. E-Protein-vermittelte Ströme wurden in Spannungsrampen zwischen –60 und +50 mV gemessen, aufgezeichnet in Abwesenheit und Anwesenheit steigender Inhibitorkonzentrationen (Abb. 5A). Die vollständige Hemmung führte zu Strömen, die auf die Größenordnung von scheintransfizierten HEK293-Zellen reduziert wurden. Wir haben relative Ströme gegen die Inhibitorkonzentration aufgetragen und die IC50-Werte mithilfe einer modifizierten Form der Hill-Gleichung \({I}_{inh}={I}_{ctr}\bullet \frac{{IC}_{50}^{ n}}{{IC}_{50}^{n}+[{inh]}^{n}}\), wobei Iinh der Strom in Gegenwart eines Inhibitors ist, Ictr der Strom in Abwesenheit eines Inhibitors ist, [inh ] ist die Konzentration des Inhibitors und n ist der Hill-Koeffizient für die Inhibition (Abb. 5B). Unsere Messungen zeigten eine Hemmung der E-Protein-vermittelten Ströme durch alle Ivermectin-Derivate außer Nemadectin. Die IC50-Werte waren: IC50 (Ivermectin) = 0,88 ± 0,1 nM, IC50 (Ivermectin-Aglycon) = 5,0 ± 1,3 nM und IC50 (Milbemycin) = 2,21 ± 0,65 µM. Bei keiner der getesteten Konzentrationen konnten wir eine Hemmung des 2-E-Proteins durch Nemadectin beobachten. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass Ivermectin und einige seiner Derivate das E-Protein bei der direkten Anwendung (Elektrophysiologie) hemmen, während die Hemmung im indirekten zellulären Test (Cell Viability Assay) für Ivermectin weitgehend reduziert und für seine Derivate nicht messbar war.

Zelllebensfähigkeitstest zur Hemmung des SARS-CoV- und CoV-2-E-Proteins durch Ivermectin (Ivm) und Derivate. Ein Zytotoxizitätstest an Kontrollzellen (scheintransfiziert). Abs595 zeigt die Lebensfähigkeit der Zellen an, statistische Signifikanzen im Vergleich zu Kontrollwerten (kein Inhibitor) (On-Way-ANOVA) sind angegeben. Ivermectin-Derivate waren in Konzentrationen ≥ 5 µM zytotoxisch, mit Ausnahme von Milbemycin, wo die Toxizität bei ~10 µM einsetzte. B Zelllebensfähigkeitstests nach der Expression von rekobinantem 1-E (graue Säulen) und 2-E (schwarze Säulen) in HEK293-Zellen. Nach der Transfektion wurden Inhibitoren angewendet. Ivermectin (Ivm) und Milbemycin (Mil) wurden in einem Bereich von 0,2 bis 2 µM getestet, während Ivermectin Agylcon (IAP) und Nemadectin (Nem) bei 0,5 bis 5 µM getestet wurden. Die Kontrolle bestand aus pRK-scheintransfizierten Zellen. Zelllebensfähigkeit von Viroporin- Die transfizierten Zellen wurden auf die Lebensfähigkeit von Kontrollzellen (scheintransfizierten Zellen, die derselben Inhibitorkonzentration ausgesetzt waren) normalisiert. Die statistische Signifikanz (einfaktorielle ANOVA) relativ zu den Lebensfähigkeitswerten von 1-E oder 2-E ohne Inhibitor ist angegeben, ns : nicht signifikant, *: p < 0,05, **: p < 0,01

Elektrophysiologische Patch-Clamp-Tests zur Hemmung des SARS-CoV-2-E-Proteins durch Ivermectin und Derivate. Eine Strom-Spannungs-Beziehung von rekombinant exprimierten Scheinkontrollen und 2-E-Protein. Die angelegten Spannungen lagen zwischen –60 und +50 mV. Kontrollströme wurden aus scheintransfizierten (pRK-Vektor) HEK293-Zellen entnommen. Die Felder von links nach rechts zeigen Ivermectin (Iv), Ivermectin-Aglycon (IA), Milbemycin (Mil) und Nemadectin (Nem). Die Konzentrationen sind in den Diagrammen angegeben. B Konzentrations-Reaktionskurven: Ströme bei -60 mV wurden um Leckstrom korrigiert (scheintransfizierte Zellen); Die für 2-E in Gegenwart eines Inhibitors beobachteten korrigierten Ströme wurden durch die korrigierten Ströme in Abwesenheit eines Inhibitors dividiert. Symbole sind in der Grafik angegeben. C Zusammenfassung der IC50-Werte von Ivermectin-Derivaten gegen rekombinantes 2-E

Das anthelminthische Avermectin wurde 1975 als Isolat aus natürlich vorkommenden Bakterien im Boden in der Nähe von Tokio, Japan, entdeckt [33]. Trotz intensiver Suche bleiben die japanischen Mikroorganismen die einzige jemals gefundene Quelle für Avermectin. Ivermectin, ein sicheres und wirksameres Avermectin-Derivat, wurde erstmals 1981 als kommerzielles Produkt für die Tiergesundheit eingeführt. Es wirkt gegen eine Vielzahl von Parasiten, darunter Magen-Darm-Spulwürmer, Lungenwürmer, Milben, Läuse und Hornfliegen [33]. In der menschlichen Gesundheit wurde Ivermectin vor allem für seine Wirksamkeit gegen eine Vielzahl innerer Infektionen bekannt, die durch Nematoden verursacht werden, darunter Onchozerkose (Flussblindheit), Ascariasis, lymphatische Filariose, Gnathostomiasis, Trichuriasis und andere [33, 42]. Das Anthelminthikum Ivermectin hemmt die neuronale Aktivität und Muskelkontraktilität bei Arthropoden und Nematoden. Es wird angenommen, dass das klassische Ziel seiner antiparasitären Wirkung ein Ivermectin-empfindlicher Glutamat-gesteuerter Chloridkanalrezeptor (GluClR) ist, der in einer Reihe von Wirbellosen vorkommt [34]. GluClRs gehören zur Familie der pentameren Cys-Loop-Rezeptoren ligandengesteuerter Ionenkanäle und kommen ausschließlich in Wirbellosen vor. Ivermectin aktiviert in höheren Konzentrationen auch Cys-Loop-Rezeptoren von Wirbeltieren, einschließlich der erregenden Nikotinrezeptoren und der inhibitorischen GABA-Typ-A- und Glycinrezeptoren [34]. Es ist bekannt, dass Ivermectin an einer bestimmten Stelle an den inhibitorischen Glycinrezeptor bindet und als vollständiger Agonist fungiert [43, 44], während es als positiver allosterischer Effektor des GABAA-Rezeptors und des neuronalen Alpha7-Nikotin-Acetylcholinrezeptors fungiert [45, 46]. Während die EC50-Werte von Ivermectin am Glycinrezeptor im µM-Bereich liegen, ist seine Wirksamkeit als Agonist von GluClR bei Wirbellosen mit EC50-Werten im niedrigen nM-Bereich 1000-fach höher [47]. Aus diesem Grund ist Ivermectin hochwirksam gegen Nematoden, stellt jedoch in geringen Konzentrationen kein Gesundheitsrisiko für den Menschen dar. Man hoffte tatsächlich, dass das E-Protein oder orf3a von SARS-CoVs ein potenzielles Ziel für Ivermectin sein könnte.

Hier untersuchten wir die Aktivität von Ivermectin auf das E-Protein von SARS-CoV-2 mithilfe einer Kombination aus einem Zelllebensfähigkeitstest und elektrophysiologischen Patch-Clamp-Aufzeichnungen ganzer Zellen. Western-Blot- und Dot-Blot-Assays bestätigten die Expression des E-Proteins auf der Außenmembran von HEK293-Zellen und die effiziente Spaltung des membransteuernden Signalpeptids. Es wurde über die Expression von Spurenmengen rekombinant exprimierten E-Proteins auf der Plasmamembran von Wirtszellen berichtet [48], die durch Zugabe des Signalpeptids verstärkt werden könnte. Der Zelllebensfähigkeitstest wurde für p7-Kanäle [29] und SARS-CoV-E-Protein [32] eingeführt und ist eine Ergänzung zu direkten Kanalaktivitätsmessungen der Patch-Clamp-Elektrophysiologie.

Zunächst verglichen wir die Aktivität der E-Proteine ​​von SARS-CoV (1-E) und SARS-CoV-2 (2-E) mit beiden Tests und stellten fest, dass rekombinantes 1-E-Protein denselben Grad an Zelltoxizität (kein signifikanter Unterschied) aufweist. E- und 2-E-Protein, exprimiert in HEK293-Zellen. Durchgängig bestätigten Patch-Clamp-Aufzeichnungen ähnliche Aktivitätsniveaus für 1-E- und 2-E-Proteine ​​nach rekombinanter Expression in HEK293-Zellen. Somit schien der Austausch von vier Aminosäureresten zwischen 1-E und 2-E (Abb. 1B) die Aktivität des Ionenkanals nicht zu beeinflussen. Als nächstes verglichen wir die Empfindlichkeit der beiden SARS-CoV-E-Proteine ​​mit klassischen Kanalblockern, die bereits für 1-E veröffentlicht wurden [32]. Im Zelllebensfähigkeitstest waren die IC50-Werte von Amantadin, Rimantadin und HMA im Vergleich zu 1-E und 2-E ähnlich. In elektrophysiologischen Aufzeichnungen beobachteten wir einen Faktor 2 zwischen beiden Varianten, während die Reihenfolge der Empfindlichkeit gegenüber den drei Inhibitoren gleich blieb. Der wirksamste Inhibitor war HMA, dann folgte Rimantadin und am wenigsten wirksam war Amantadin. Die beobachteten Unterschiede zwischen den E-Protein-Varianten 1-E und 2-E waren höchstwahrscheinlich auf expressionsspezifische Unterschiede zurückzuführen, insbesondere da die Sequenz der Hemmwirkung und die allgemeine Kanalaktivität zwischen beiden E-Protein-Varianten unverändert waren.

Schließlich untersuchten wir die Wirkung von Ivermectin und drei Derivaten auf das 2-E-Protein. Kürzlich wurde gezeigt, dass Ivermectin in vitro in Vero-h/SLAM-Zellen eine 5000-fache Reduktion der SARS-CoV-2-Virus-RNA zeigt [49]. Es wurden mehrere Mechanismen vorgeschlagen, durch die Ivermectin das durch SARS-CoV-2 verursachte COVID-19 hemmen könnte. Molekulare Docking-Ansätze legen nahe, dass die Hemmung der RNA-abhängigen RNA-Polymerase, die für die Virusreplikation erforderlich ist, durch Ivermectin COVID-19 hemmt [50], während eine andere Studie ergab, dass Ivermectin auf das Importin-α/β1-Heterodimer abzielt, was zur Abschaffung des nuklearen Transports von führt SARS-CoV-2 [51]. Nach unserem Kenntnisstand wurden bisher keine Daten darüber veröffentlicht, dass das 2-E-Protein ein potenzieller Bindungspartner für Ivermectin ist. Tatsächlich wurden in den letzten zwei Jahren zahlreiche In-vivo-Studien veröffentlicht, die zu erheblich unterschiedlichen Ergebnissen führten. Diese Diskrepanz lässt sich erklären, wenn man die kombinierte Wirkung der antiviralen und zytotoxischen Aktivitäten von Ivermectin berücksichtigt. Zu den Studien gehörte der Einsatz von Ivermectin zur Prophylaxe gegen leichte bis mittelschwere COVID-19-Fälle und bei Patienten, die eine Intensivpflege benötigen. Während einige Studien Ivermectin als den ersten Wirkstoff betrachten, der sowohl zur Prävention von COVID-19 als auch zur Behandlung aller Phasen, einschließlich der ambulanten Behandlung der frühen symptomatischen Phase, wirksam ist [37, 52, 53, 54]; andere Studien kommen zu dem Ergebnis, dass Ivermectin überhaupt keine Wirkung hat [55, 56]. In mehreren Studien wurde eine schützende Wirkung von Ivermectin bei der Behandlung von Patienten festgestellt, die Unterschiede waren jedoch statistisch nicht signifikant oder es wurde von einer geringen Evidenzsicherheit berichtet [39, 57]. Trotz der unklaren klinischen Situation und Warnungen vor seiner Verwendung wurde Ivermectin in mehreren Ländern zur Behandlung von COVID-19 beworben.

Unsere Studie konzentrierte sich auf In-vitro-Untersuchungen, um herauszufinden, ob Ivermectin auf das E-Kanal-Protein von SARS-CoV-2 wirkt. Der E-Kanal wird intrazellulär im endoplasmatischen Retikulum-Golgi-Intermediat-Kompartiment (ERGIC) exprimiert [23]. Deshalb muss im Zelllebensfähigkeitstest jedes Medikament in die transfizierten HEK293-Zellen gelangen, nur dann kann seine hemmende Wirkung den Zellschaden aufgrund der E-Protein-Aktivität reduzieren. Ivermectin ist hydrophob und membrangebunden; im Falle des Glycinrezeptors befindet sich seine Bindungstasche innerhalb der extrazellulären Transmembranregion [58]. Ivermectin gelangt möglicherweise nicht in einer ausreichend hohen Konzentration in die Zellen, um das E-Protein wirksam zu hemmen. In unseren Experimenten waren die verfügbaren Konzentrationen des Arzneimittels begrenzt, da Ivermectin und seine Derivate bei Konzentrationen um 2–10 µM, also im für die E-Protein-Hemmung erforderlichen Konzentrationsbereich, zytotoxisch waren. Ivermectin-Toxizität in therapeutischen Dosen wurde bereits zuvor an primären Fibroblastenzellen von Hühnern beobachtet [36]. In der Patch-Clamp-Elektrophysiologie verwendeten wir ein Plasmid, das eine Signalsequenz enthielt, um den E-Protein-Kanal zur Außenmembran zu leiten. Hier wurde das Viroporin Inhibitoren im extrazellulären Puffer ausgesetzt und wir konnten die Aktivität der angewendeten Inhibitoren direkt untersuchen. Dies war der Grund für niedrigere IC50-Werte im Vergleich zum indirekten Zelllebensfähigkeitstest für die klassischen Inhibitoren. Für Ivermectin und einige seiner Derivate fanden wir einen IC50-Wert ähnlich dem von Rimantadin (IC50 = 3,6 ± 0,6 nM). Unter Verwendung von Strom-Spannungs-Beziehungen, die in Gegenwart und Abwesenheit eines Inhibitors gemessen wurden, fanden wir, dass Ivermectin die höchste Aktivität aufwies (IC50 = 0,88 ± 0,1 nM), Milbemycin war etwas weniger aktiv (IC50 = 2,21 ± 0,65 nM), gefolgt von Ivermectin-Aglycon (IC50 =). 5,0 ± 1,3 nM); Nemadectin war in unseren Messungen inaktiv. Unsere elektrophysiologischen In-vitro-Daten zeigen, dass Ivermectin tatsächlich als Inhibitor des E-Kanals mit einer ähnlichen Wirksamkeit wie Rimantadin wirkt. Diese Aktivität konnte in Zelllebensfähigkeitstests nicht nachgewiesen werden, was wahrscheinlich auf die ineffiziente Arzneimittelabgabe in die intrazellulären Kompartimente von HEK293-Zellen und die Zelltoxizität von Ivermectin und seinen Derivaten zurückzuführen ist. Unsere Daten stimmen mit Literaturergebnissen überein, die zeigen, dass Ivermectin einige positive Wirkungen bei der Behandlung von SARS-CoV-2-infizierten Patienten hat. Die beobachteten Diskrepanzen könnten durch die Ineffizienz der Arzneimittelabgabe erklärt werden. Die meisten Studien beschrieben moderate Auswirkungen für COVID-19-infizierte Patienten, die an der Grenze der statistischen Signifikanz lagen. Bei der Untersuchung der Prophylaxe war der positive Effekt der Ivermectin-Behandlung stärker ausgeprägt. Diese Ergebnisse stimmen darin überein, dass Ivermectin eine hemmende Wirkung auf das Virus hat – gegen das E-Protein oder andere Proteine ​​–, jedoch mit geringer Wirksamkeit. Wenn die Viruslast bereits zu einem Zeitpunkt hoch ist, an dem Patienten COVID-19-Symptome beobachten, hat die Behandlung mit Ivermectin keine Wirkung. Bei prophylaktischer Anwendung könnte Ivermectin möglicherweise die Ausbreitung des Virus hemmen, allerdings nur in Konzentrationen, bei denen bereits die Gefahr zytotoxischer Nebenwirkungen besteht.

Diese Studie zeigt, dass antivirale Medikamente direkt auf das E-Protein von SARS-CoV und SARS-CoV-2 abzielen. Ivermectin und einige seiner Derivate können wirksame Inhibitoren des E-Protein-Kanals sein, ihre Zytotoxizität könnte sie jedoch für eine therapeutische Anwendung ungeeignet machen. Daher müssen die Aktivität gegen das virale Zielprotein sowie kompromittierende Nebenwirkungen sorgfältig bewertet werden. Viroporine wie die E- und 3a-Proteine ​​von SARS-CoVs bleiben vielversprechende und relevante Ziele bei der Suche nach neuartigen antiviralen Medikamenten.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Wir danken Mousa A. Mousa für die hervorragende technische Unterstützung.

Diese Forschung erhielt keine spezifischen Zuschüsse von Förderstellen im öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Sektor.

Abteilung für Biochemie, Deutsche Universität in Kairo, Haupteingang von Al Tagamoa Al Khames, New Cairo, 11835, Ägypten

Ulrike Breitinger, Christine Adel Sedky & Hans-Georg Breitinger

Division of Bioinformatics, Institute for Biochemistry, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, Germany

Heinrich Sticht

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UB: Konzeption, Gestaltung der Arbeit, Datenerfassung und -analyse, Interpretation der Daten, Entwurf, Verfassen und Überarbeiten des Manuskripts. CS: Datenerfassung und -analyse, Interpretation der Daten, Überarbeitung des Manuskripts. HS: Konzeption, Datenanalyse, Interpretation der Daten, Überarbeitung des Manuskripts. HGB: Konzeption, Gestaltung der Arbeit, Datenerfassung und -analyse, Interpretation der Daten, Entwurf, Verfassen und Überarbeiten des Manuskripts. Alle Autoren haben die eingereichte Version (und jede wesentlich geänderte Version, die den Beitrag des Autors zur Studie beinhaltet) genehmigt. Alle Autoren haben zugestimmt, sowohl persönlich für ihre eigenen Beiträge verantwortlich zu sein als auch sicherzustellen, dass Fragen im Zusammenhang mit der Richtigkeit oder Integrität eines Teils des Werks, auch solcher, an denen der Autor nicht persönlich beteiligt war, angemessen untersucht, gelöst und überprüft werden Auflösung in der Literatur dokumentiert.

Korrespondenz mit Ulrike Breitinger.

Unzutreffend.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Breitinger, U., Sedky, CA, Sticht, H. et al. Patch-Clamp-Studien und Zelllebensfähigkeitstests deuten auf eine eindeutige Stelle für Viroporin-Inhibitoren auf dem E-Protein von SARS-CoV-2 hin. Virol J 20, 142 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02095-y

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Eingegangen: 30. Juli 2022

Angenommen: 08. Juni 2023

Veröffentlicht: 08. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02095-y

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